[发明专利]采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的方法

说明书

本发明公开了一种采用荧光RT‑PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60相对表达量的方法。本发明中周氏啮小蜂Hsp60实时荧光RT‑PCR检测方法的建立，为研究周氏啮小蜂Hsp60表达调控机理及其生态防治奠定基础。研究温度的变化对于周氏啮小蜂体内Hsp60基因表达量的影响，研究结果可为科学利用天敌昆虫周氏啮小蜂提供理论基础，这对于以后在何种室外温度下放飞周氏啮小蜂防治美国白蛾具有重要意义。本发明为在mRNA水平对Hsp60基因的相对定量分析提供了技术平台。

本发明得到：国家自然科学基金（31201730）；天津市高等学校科技发展计划项目（20110602）；天津师范大学博士基金（52XB1003）及天津市动植物抗性重点实验室开放基金的资助。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及用于检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的特异性引物，更具体的说是一种采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的方法。主要用于周氏啮小蜂Hsp60基因表达调控机理及其生态防治的研究，研究结果可为科学利用天敌昆虫周氏啮小蜂进行生物防治提供理论基础。

背景技术

热激蛋白 Heat shock protein (Hsp) 是一类在生物体内广泛存在的，对体内外环境变化极为敏感的高保守性蛋白质，广泛参与了各种生理代谢途径，近年来已成为生物研究领域中的一个热点。根据其分子量的大小可将其分为不同的蛋白家族，其中Hsp60与温度胁迫应激性密切相关。温度是影响生物体生存至关重要的环境因子，只有在一定的温度范围内生物体才能进行物质能量代谢以维持正常生理活动，超出温度的耐受范围都会使生物的生长发育停滞甚至死亡。一般来说生物体受到高温或低温刺激后，蛋白合成量会有显著变化，用以增强抗逆境能力。由于热激蛋白会在胁迫消除后一段时间内保持一定的含量使生物体更好生存，可以认为其存在对于生物体适应环境有着重要作用。

周氏啮小蜂Chouioiacunea Yang 是我国重要入侵物种美国白蛾Hyphantriacunea（Drury）的重要寄生性天敌，体长1.1-1.5 mm，群集内寄生于美国白蛾蛹中，是抑制美国白蛾的主要天敌因子，对控制美国白蛾的危害起到重要作用。除寄生于美国白蛾外，还可寄生于鳞翅目的枯叶蛾科、毒蛾科、舟蛾科、尺蛾科、菜蛾科和双翅目的蝇科、寄蝇科及鞘翅目的叶甲科和瓢甲科等。

通过野外释放C. cunea可以达到有效防治美国白蛾的目的。然而，在野外环境下，C. cunea的活力会受到多重因素的影响，其中，温度作为一个主要生态因素，会影响C. cunea的生命力。在合适的温度范围投放小蜂，才会起到更好的防治效果。

实时荧光PCR技术是在常规PCR技术的基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光PCR不仅实现了常规PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，实时荧光PCR技术由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，可进一步提高灵敏度；实时荧光PCR技术全封闭反应，无须PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。目前，已广泛应用于分子生物学和医学研究等领域。随着实时荧光PCR试剂盒的进一步开发，近年来，实时荧光PCR技术在动物生态防治中也得到了广泛的应用。

发明内容

本发明的目的是公开一种采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下:

设计一种采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的特异性引物，其特征在于包括符合荧光PCR反应特点的特异上下游引物：Hsp60-F：5'-TGCGATGAACAACGAATA-3'; Hsp60-R：5'-CGTCAATAGTGAAGCGACT-3'；