[发明专利]一种调控猪AEBP1的启动子及构建方法、转染载体及构建方法、应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种调控猪AEBP1的启动子及启动子的构建方法，含有启动子的转染载体及转染载体的构建方法和应用，属于动物基因工程技术领域。

背景技术

高等生物基因的表达受到细胞内外环境的精细调控，因而具有严格的时间及空间有序性。基因的表达调控由多阶段调控水平共同完成，它是一个复杂且有序的过程，主要包括转录前、转录、转录后、翻译、翻译后五个水平，其中转录水平调控最为关键。启动子是转录水平上的重要调控元件，它位于DNA结构基因5′端上游区，通过与转录因子互作来调控基因的表达(武力，1999)。因此，通过对启动子的结构、功能、作用模式等方面的研究，有助于更好地了解基因如何发挥其功能。

aP2是脂肪细胞分化的标志基因，它的启动子区域存在脂肪细胞分化过程中已知的两个重要因子C/EBPa和PPARγ的结合位点，为上调表达。近年来，在aP2基因启动子邻近增强子区域AE-1发现了另外一个重要的转录因子-脂肪细胞增强子结合蛋白(AEBP1)。

AEBP1是一种转录抑制物，兼具蛋白酶和DNA结合活性(Heetal.,1995)，是调节性B样(regulatoryB-like)羧肽酶家族的一员(MuiseandRo,1999)，因此，AEBP1具有羧肽酶(carboxypeptidase，CP)活性，在脂肪生成中表达下调。AEBP1中CP区突变后造成CP活性缺失，使得AEBP1失去抑制转录活性，反之若AEBP1具有CP活性就能够抑制转录，因此AEBP1的CP活性对于其行使转录调控功能极其重要(Heetal.,1995)。关于AEBP1调节转录抑制功能的具体机制尚不清楚，可能是通过剪切一般性转录因子而实现。研究发现，利用酵母双杂交系统，显示AEBP1与G蛋白异源三聚体γ5亚基有蛋白互作。AEBP1的转录抑制功能由Gγ5调节，而Gγ5的抑制活性由脂肪生成刺激调节，因此，AEBP1在脂肪生成过程中可以作为信号因子Gγ5的效应器(Parketal.,1999)。此外，研究还表明AEBP1能调节丝裂素活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)的活性。

AEBP1在脂肪细胞分化过程中具有非常重要的生物学作用。在小鼠3T3-L1细胞系中，AEBP1的表达量在细胞分化初期最高，随着分化时期的增加逐渐降低，在分化末期未见表达(Heetal.,1995)。AEBP1在人体的表达与之相似，研究显示，在人的初代培养造骨细胞中能分离到AEBP1基因cDNA，但最后的硬化期则关闭表达(Ohnoetal.,1996)。

AEBP1有两种不同的转录本，分别编码2种不同的蛋白质，即AEBP1和主动脉羧肽酶类样蛋白(Aorticcarboxypeptidase-likeprotein,ACLP)，而ACLP是AEBP1的非核内同形异构体，该蛋白的N端与AEBP1相比多了380个氨基酸。两种同形异构体分别由AEBP1基因通过选择性剪切机制产生的两种mRNA所编码，其功能也完全不同(Roetal.,2001)。原位杂交显示ACLP在主动脉平滑肌细胞内表达，而骨骼肌细胞内不表达，在血管平滑肌细胞分化中表达上调(Layneetal.,1998)，而AEBP1在脂肪细胞分化中则表达下调(Heetal.,1995；Kimetal.,2001)。AEBP1在脑中表达最高，次之的是白色脂肪组织，肾和心脏，在棕色脂肪组织、骨骼肌、小肠、肺、脾及睾丸均有表达(Roetal.,2001)。Western杂交显示ACLP主要分布于成年鼠主动脉平滑肌细胞内，而动脉外膜、心、肝、骨骼肌或肾中则不表达(Layneetal.,1998)。因此，对AEBP1基因，尤其是对AEBP1启动子的研究具有重要意义。截止目前，尚见到研究猪AEBP1基因启动子功能的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种调控猪AEBP1的启动子及启动子的构建方法，含有启动子的转染载体及转染载体的构建方法和应用，该启动子活性较强，具备独立的启动功能。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是提供一种调控猪AEBP1的启动子，所述启动子为SEQIDNO.10、SEQIDNO.11或SEQIDNO.12所示的核苷酸序列。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种调控猪AEBP1的启动子的构建方法，包括以下步骤：

(1)以GenBank登录号：CU928907的核苷酸序列为模板，设计正反向引物F/R，PCR扩增，选择扩增片段第一外显子ATG上游2000bp序列作为启动子候选片段；