[发明专利]重组人表皮生长因子发酵方法

权利要求书

1.重组人表皮生长因子发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)培养基的准备：由以下重量比例成分制成：

所述微量金属离子为三氯化铁、氯化钙、钼酸钠、氯化锌、硫酸铜、硼酸、硫酸铝中的一种；

用磷酸盐缓冲液调pH为5.5-6.5；

所述促进剂采用以下方法制备：

①原料处理：将积雪草和金银花按照等重混合、洗净、干制、粉碎；

②蒸汽爆破处理：将步骤①得到的物料放入蒸汽爆破罐，爆破压力3.0-3.5Mpa，保压时间维持在150-200s；

③蒸馏处理：将步骤②得到的物料放入蒸馏器，在蒸馏器底部，加热燃烧或通入蒸汽，当炙热的蒸气充满在蒸馏器里，水蒸气通过冷凝管，被引入冷凝器内，再通过油水分离器，收集精油；

④高剪切均质机处理：将步骤③得到的精油通过高剪切均质机处理，线速度30-40m/s，时间3-5min，制成纳米乳，并用微孔滤膜过滤除菌得到；

2)发酵、表达：应用2L摇瓶及20L原位灭菌发酵罐培养遗传工程菌株，以1O％培养基接种后，添加诱导剂，30℃培养，控制pH7.0，氧饱和度10-50％，搅拌150-170rpm，罐压0.01378-0.03445MPa，流加甘油至每L湿菌达100-300g后流加甲醇保持其浓度为1％以进行EGF的诱导表达；

3)分离：表达结束，离心分离，收集上清既得重组克隆菌株离心液。

2.根据权利要求1所述的重组人表皮生长因子发酵方法，其特征在于，步骤1)所述培养基由以下重量比例成分制成：

所述微量金属离子为三氯化铁、氯化钙、钼酸钠、氯化锌、硫酸铜、硼酸、硫酸铝中的一种；

用磷酸盐缓冲液调pH为6.0；

所述促进剂采用以下方法制备：

①原料处理：将积雪草和金银花按照等重混合、洗净、干制、粉碎；

②蒸汽爆破处理：将步骤①得到的物料放入蒸汽爆破罐，爆破压力3.0-3.5Mpa，保压时间维持在150-200s；

③蒸馏处理：将步骤②得到的物料放入蒸馏器，在蒸馏器底部，加热燃烧或通入蒸汽，当炙热的蒸气充满在蒸馏器里，水蒸气通过冷凝管，被引入冷凝器内，再通过油水分离器，收集精油；

④高剪切均质机处理：将步骤③得到的精油通过高剪切均质机处理，线速度30-40m/s，时间3-5min，制成纳米乳，并用微孔滤膜过滤除菌得到。

3.根据权利要求1或2所述的重组人表皮生长因子发酵方法，其特征在于：所述积雪草、金银花的使用量，粉碎后的体积相当于蒸汽爆破罐体积的1/4-1/3。

4.根据权利要求1所述的重组人表皮生长因子发酵方法，其特征在于：步骤2)所述诱导剂为甲醇，用量1.2-1.8％。