[发明专利]一种吡咯并喹啉醌PQQ二钠盐杂质的分离纯化方法

权利要求书

1.一种吡咯并喹啉醌PQQ二钠盐杂质的分离纯化方法，其特征在于步骤为：

（1）PQQ溶解性的考察：在含10%四丁基氢氧化铵的0.04M磷酸二氢铵缓冲溶液（pH7.0）作溶剂时PQQ溶解度达到10mg/mL，满足制备HPLC上样的要求；

（2）优化制备分离条件

选择四丁基氢氧化铵作为离子对试剂，选用0.04M磷酸二氢铵作缓冲体系；

色谱柱的选择：选择GPC18型号的色谱柱；

流动相配比的优化：

流动相A：Buffer的配制：称取12.974g的10%四丁基氢氧化铵水溶液，4.6g磷酸二氢铵，加水至1L，用磷酸调至pH7.0；用0.45μm滤膜过滤；

流动相B：乙腈ACN；

流动相A/流动相B的体积比为80/20~70/30之间主峰与杂质分离较好，而且杂质峰对称性较好；

pH值的影响：选择pH7.0；

（3）制备柱上的分离

上样液的配制：以流动相A为溶解溶液，配制10mg/mL的PQQ溶液，0.45μm滤膜过滤；

选择柱子：GPC18：5μm，21.2×250mm；

流动相采用：Buffer︰ACN=80～70︰20～30，v/v；

柱温：室温；

流速：20mL/min；

进样体积：10mL；

压力：1756psi；

检测波长：225nm；

（4）收集的杂质纯度鉴定

a、收集液的处理

浓缩：将制备柱得到的收集液在60℃下旋转浓缩5倍，得浓缩液；

盐析：在浓缩液中加入1.5M的氯化钠溶液，使收集的馏分溶液中最终的氯化钠浓度达到0.8-1.0M，用HCl调至pH2.0；将上述溶液在4℃下静置48h；

过滤：用0.45μm滤膜过滤盐析液，将沉淀滤出，再次用去离子水洗涤沉淀2次；

干燥：将带沉淀的滤膜置于40℃下真空干燥24h；

将样品从滤膜上刮下，置于样品瓶中，称重；包装；

b、样品纯度鉴定

分析柱：GPC18：5μm，4.6×250mm

流动相：Buffer︰ACN体积比70︰30；

柱温：室温；

流速:1mL/min；

进样体积：20μL；

检测波长：225nm；

分析过程中出峰时间略有漂移，采用内标法确认了所制备产物为目标杂质，所制备产物的纯度大于95%；

（5）杂质结构鉴定

所收集的杂质组分采用质谱MS/高分辨质谱HRMS、红外吸收光谱IR、核磁共振谱NMR对PQQ杂质进行分析，最后确证其分子式及化学结构和化学名称，即本杂质的分子式为C₁₄H₃N₂O₈ClNa₂，化学名称为3-氯-1H-吡咯[2,3-f]喹啉-2,7,9-三羧酸-二钠盐。