[发明专利]口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及兽用生物诊断制品技术领域，具体涉及口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

口蹄疫（Footandmouthdisease，FMD）是由口蹄疫病毒（Footandmouthdiseasevirus，FMDV）引起的偶蹄动物发生的急性、热性和高度接触性传染病。口蹄疫在欧洲、亚洲、非洲、南北美洲及大洋洲历史上皆有过发生，欧洲、亚洲、拉丁美洲、非洲在近代史上从未间断发生。它破坏性很大，对生产、生活和经济等方面造成严重的危害，被世界动物卫生组织列为A类传染病之首。口蹄疫病毒具有多型性，共有7个血清型。不同血清型口蹄疫病毒之间，不能产生交互免疫，因此，快速准确地对口蹄疫病毒定型在口蹄疫的研究和防疫中至关重要。

我国周边国家和地区存在口蹄疫的流行，印度和中亚地区存在多种血清型病毒，印度素有“毒库”之称，中亚地区也被称为“病毒走廊”，我国有不同血清型病毒侵入的危险。当前对我国威胁较大的是O型、A型、AsiaI型3种血清型，O型、A型、AsiaI型3种血清型的RNA序列同源性为60％～70％。编码结构蛋白的Pl区比编码非结构蛋白的其他区域差异更大。用于设计分型引物的lD片断同源性约60％，而且同一血清型的病毒差异也比较大。这就给引物设计带来了困难。在引物设计时，要综合考虑方法的特异性和检出率，具有良好特异性的同时，叉要具有高检出率。本发明下载了49条O型FMDV序列、34条AsiaI型序列和57条A型序列，在充分比较同源性的基础上，选取了多个血清型之间同源性低、血清型内同源性高的基因区段。最后经过筛选，选取了比较理想的区段设计引物，在众多参考序列的基础上，提高了检出率。因此本发明建立的多重RT-PCR方法旨在用于区分这3种血清型病毒。

控制FMD的关键在于早发现、早隔离、早预防，因而快速、敏感、可靠的诊断方法受到人们的重视。目前，国内检疫、诊断该病常用的方法有病毒分离和酶联免疫吸附试验等，这些方法或需长时间才能获得检测结果，或检出率低。聚合酶链式反应（PCR）具有灵敏性高、特异性强、操作简便等特点，已被广泛用于分子生物学各个领域，在分子克隆、疾病诊断等方面发挥着重要作用。相对常规诊断方法。PCR检测准确、直接，对于口蹄疫病毒的快速定型具有重要意义。荧光PCR相较普通PCR操作更加方便快捷、灵敏度更高。因此，本发明利用荧光定量RT-PCR来区分O型、A型和AsiaⅠ型的FMDV，设计了3对引物和3条探针，并组建一种口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒。

本发明为解决上述问题所采取的技术方案是：口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒，包括病毒RNA提取试剂和RT-qPCR扩增试剂，其中RT-qPCR扩增试剂包括扩增反应液、酶系、阳性对照和阴性对照；

所述扩增反应液为5×HSOne-stepRT-PCRbuffer、三对引物、三条TaqMan荧光探针和灭菌超纯水的混合物；

用于检测口蹄疫病毒O型、A型和AsiaⅠ型的荧光定量RT-PCR引物和探针序列如下：

所述酶系为SuperM-MLVReverseTranscriptase、HotstartHiTaqDNAPolymerase和酶缓冲液混合物；

所述阳性对照为含FMDV病毒O型、A型、AsiaⅠ型基因片段的T载体质粒混合物，阴性对照为灭菌超纯水。

上述口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒，所述病毒RNA提取试剂包括平衡液BL、缓冲液RG、缓冲液RD、缓冲液RW、RNA洗脱液、RNaseFree吸附柱和收集管、RNaseFree离心管以及实时荧光8联排管。

有益效果

本发明根据口蹄疫病毒O型、A型和AsiaⅠ型的基因序列，设计3对特异性引物和3条探针，能在一次PCR扩增过程中实现对口蹄疫病毒不同基因型的监测。本发明包含了病料提取RNA和RT-qPCR扩增所需的全部试剂，不需操作人员再另外准备，具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，可最大限度的减少人为误差。

附图说明

图1是本发明试剂盒对口蹄疫病毒O型-A型-AsiaⅠ型混合物的三重检验结果；

图2是本发明试剂盒对O型口蹄疫病毒的敏感性试验结果；