[发明专利]检测桑丁香假单胞菌的引物及其应用

权利要求书

1.检测桑丁香假单胞菌的引物在荧光定量PCR检测中的应用，其特征在于包括以下步骤：

1）利用KB液体培养基培养病原菌，制备病原菌菌悬液，同时采用Biospin细菌全基因组DNA提取试剂盒提取病原菌总DNA，制备菌液和DNA标准样品；

2）特异性引物设计，对致病性的桑丁香假单胞菌设计了其特异性的引物对Psm240F/Psm434R，所述引物对为：正义引物Psm240F序列为：5'-AAGGTAACGGGGCTAAT-3'，反义引物Psm434R序列为：5'-GCTGTTGACCGATGATAT-3'；

3）实时荧光定量PCR检测方法反应体系为：20 μL反应体系中，包含10 μL SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×)，0.8 μL Psm240F 10 µM ，0.8 μL Psm434R 10 µM ，0.4 μL ROX Reference Dye(50×)，2.0 μL模板为标准病原菌菌悬液和DNA稀释液或待测样品的菌悬液，6 μL双蒸水；

4）实时荧光定量PCR检测方法扩增程序为：两步法扩增程序：第一步：95 ℃预变性10min；第二步：95 ℃变性15 s，60 ℃延伸31 s，反应共计45个循环，PCR完成后，按0.1 ℃/s升温速率从72 ℃升至95 ℃进行融解曲线的分析验证；

5）取步骤1）中得到的病原菌菌悬液经平板计数法定量并进行梯度稀释，稀释成9个不同的浓度梯度：1 × 10⁸ cfu/mL，5 × 10⁷ cfu/mL，1 × 10⁷ cfu/mL，5 × 10⁶ cfu/mL，1× 10⁶ cfu/mL，1 × 10⁵ cfu/mL，1 × 10⁴ cfu/mL，1 × 10³ cfu/mL，1 × 10² cfu/mL，同时，取步骤1）中病原菌的全基因组DNA经ND-1000 V3.7.1定量并10倍梯度稀释，稀释成6个不同的浓度梯度：6.0 ng/μL，6.0 × 10^-1 ng/μL，6.0 × 10^-2 ng/μL，6.0 × 10^-3 ng/μL，6.0 × 10^-4 ng/μL，6.0 × 10^-5 ng/μL，以不同浓度梯度的菌悬液和DNA为模板按照上述PCR反应体系和扩增程序进行扩增；反应结束后，根据各个浓度梯度的循环阈值（Ct）采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线。