[发明专利]一种沉默水稻过氧化氢酶基因OSCAT2的sgRNA在审
| 申请号： | 201510848195.X | 申请日： | 2015-11-27 |
| 公开（公告）号： | CN105255885A | 公开（公告）日： | 2016-01-20 |
| 发明（设计）人： | 胡丽芳;贺浩华;刘世强;朱昌兰;彭小松;贺晓鹏;傅军如;陈小荣;欧阳林娟;边建民;孙晓棠;徐杰;周大虎 | 申请（专利权）人： | 江西农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/11 | 分类号： | C12N15/11;C12N15/82;C12N15/66 |
| 代理公司： | 南昌洪达专利事务所 36111 | 代理人： | 刘凌峰 |
| 地址： | 江西省南昌市经济*** | 国省代码： | 江西;36 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 沉默 水稻 过氧化氢酶 基因 oscat2 sgrna | ||
1.一种沉默水稻过氧化氢酶基因OSCAT2的sgRNA，其特征在于：DNA序列如SEQIDNO.1所示。
2.靶向沉默水稻过氧化氢酶基因OSCAT2的载体，其特征在于：含有特异性靶向OSCAT2基因第三外显子的sgRNA的表达载体和Cas9蛋白的体外转录载体，其中sgRNA序列上游为水稻U6启动子，Cas9上游为玉米加强型启动子，筛选标记为潮霉素。
3.权利要求2所述靶向沉默水稻过氧化氢酶基因OSCAT2的载体构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)目标靶序列：根据在线软件http://crispr.mit.edu/设计OSCAT2基因的靶标序列，具体的操作步骤为在OSCAT2的全长开放阅读框，搜索5’GGN-N(20)-3’类的序列，然后根据其综合评分、脱靶情况，选择合适的目标靶序列，其DNA序列如SEQIDNO.2所示；
(2)sgRNA序列：SEQIDNO.2序列去除末端TGG的序列，其DNA序列如SEQIDNO.1所示；sgRNA反向互补序列：SEQIDNO.1的方向互补序列，其DNA序列如SEQIDNO.3所示；
(3)获得Oligo二聚体：在sgRNA序列的5端引入6个额外的碱基TGTGTG获得SEQIDNO.4序列；在sgRNA反向互补序列的5端引入4个额外的碱基AAAC，3端引入2个额外的碱基CA获得SEQIDNO.5序列；人工合成SEQIDNO.4和SEQIDNO.5的序列并将其制备成Oligo二聚体；
(4)将制备好的Oligo二聚体构建至BGK03的U6启动子上游，转化大肠杆菌DH5a获得干扰载体BGK03-OSCAT2。
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