[发明专利]一种B族链球菌PCR荧光探针法核酸检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种B族链球菌核酸检测试剂盒，具体涉及一种B族链球菌PCR荧光探针法核酸检测试剂盒。

背景技术

B族链球菌(groupBstreptococcus,GBS)是一种寄生于人类泌尿生殖道及下消化道的条件致病菌，健康人群带菌率可达35％。早在20世纪70年代B族链球菌就已经被证实为围产期母婴感染的重要致病菌之一。定植于产妇生殖道的B族链球菌，可在分娩时垂直传播给新生儿，而新生儿B族链球菌感染所引起的新生儿败血症、脑膜炎和肺炎等症致死率极高，并可导致神经系统后遗症。2010年美国疾病预防中心制定了《围产期GBS预防指南》，建议孕妇于妊娠35-37周进行GBS筛查。

目前,B族链球菌的诊断方法主要有培养法和免疫学方法，其中，培养法的特异性和敏感性高，但临床检测时间过长(至少需要24h-48h，甚至更长时间)，过程繁琐，需要使用特殊的培养介质以及易受杂菌影响，不适用于大范围检测。免疫学方法，如：乳胶凝集实验(latexagglutination,LA)，酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)，协同凝集试验(countercurrentimmunoelectrophotesis,CoA)及对流免疫电泳(countercurrentimmunoelectrophotesis,CIE)等，虽然特异性可以高达95％，但是敏感性不够，检出率较低。美国FDA已于1997年发出了这些方法假阴性和假阳性率均很高的可行度警告，加之其试剂盒价格昂贵，所以这些方法的应用迅速减少。

近年来，聚核酶链式反应(PCR)法渐渐显现了其在检测上的优势，标准PCR过程分为三步：DNA变性(90℃-96℃)：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA；退火(60℃-65℃)：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链；延伸(70℃-75℃)：在Taq酶(在72℃左右，活性最佳)的作用下，以脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，最终合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。

运用PCR技术检测主要涉及到两个方面：核酸的提取和核酸的扩增检测。目前，国内临床上主要采用煮沸法对B族链球菌的核酸进行提取：先将分泌物样本浓缩、洗涤，再加裂解液，煮沸，高速离心，取上清为模板。步骤繁琐，而且各厂家浓缩和裂解效率差异较大，样本依赖性强，对于较复杂的样本提取效率低。

荧光定量PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏、更特异、更精确的核酸检测技术。检测结果准确，重复性高，能动态反应患者治疗前、后病原体动态变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统PCR需后处理的问题，减少了污染。实时荧光定量PCR技术使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值(即定量检测)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。研究显示，实时荧光PCR检测方法与标准的细菌培养方法在GBS检测的敏感性和特异性方面均达90％以上，达到筛检标准，已经得到美国食品和药品管理局(FDA)的批准并应用于临床。因此，在国内采用实时荧光PCR技术进行GBS筛检是最快速、可靠的方法。