[发明专利]一种沙眼衣原体/淋球菌核酸检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种沙眼衣原体/淋球菌核酸检测试剂盒，具体涉及一种荧光定量PCR沙眼衣原体/淋球菌核酸检测试剂盒。

背景技术

沙眼衣原体(CT)是一种具有独特发育周期、严格细胞内寄生的原核细胞型微生物，是一类介于病毒、细菌和立克次体之间的特殊微生物，在微生物分类上属于细菌门、立克次体纲、衣原体目及衣原体属。是国内外最常见的性病病原体之一，在我国生殖道衣原体感染居STD的第三位，且其发病率有逐年增高的趋势。机体感染CT后，能诱导产生型特异性细胞免疫和体液免疫，但通常免疫力不强，且维持短暂，因而常造成持续感染、隐性感染和反复感染。

奈瑟淋球菌(Neisseriagonorrheae，NG)1879年由Neisser发现，俗称淋病双球菌或淋球菌，是引起人类淋病的致病病原体，属奈瑟菌属。淋球菌(NG)有严格的人类寄生性，对人体有较强的适应和侵袭能力，其主要致病物质包括菌毛、外膜蛋白、蛋白酶、脂多糖等，是发展中国家发病率较高的性传播疾病之一。NG主要通过性接触直接感染，也可以通过接触患者的衣物或马桶等间接感染，还可以通过产道感染分娩时的胎儿。

目前沙眼衣原体和淋球菌的诊断方法主要有培养法和免疫学方法，其中，培养法的特异性和敏感性高，但临床检测时间过长(至少需要24h-48h，甚至更长时间)，过程繁琐，需要使用特殊的培养介质以及易受杂菌影响，不适用于大范围检测。免疫学方法简便快捷，但特异性差、灵敏度不高。近年来，聚核酶链式反应(PCR)法渐渐显现了其在检测上的优势，标准PCR过程分为三步：DNA变性(90℃-96℃)：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA；退火(60℃-65℃)：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链；延伸(70℃-75℃)：在Taq酶(在72℃左右，活性最佳)的作用下，以脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，最终合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。

运用PCR技术检测主要涉及到两个方面：核酸的提取和核酸的扩增检测。

目前，国内临床上主要采用煮沸法对沙眼衣原体和淋球菌的核酸进行提取：先将分泌物样本浓缩、洗涤，再加裂解液，煮沸，高速离心，取上清为模板。煮沸法具有诸多不足之处：1)核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低，同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤，容易造成气溶胶污染。2)检测灵敏度不高，约在10000copies/ml左右；3)没有设置阳性内对照(即内标)，无法监控假阴性；4)一般没有预防PCR产物污染的措施。另外，对于浓缩这一步，不同厂家的浓缩效果不一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到，看得到沉淀的是因为将病毒与蛋白都浓缩了，这样，导致后面加入裂解液时很难充分混匀；无法看到沉淀，使操作者无法确定吸弃上清时会不会吹打到病毒核酸。