[发明专利]一种利用短链引物阻遏提高DNA克隆及组装效率的方法

说明书

本发明公开了一种利用短链引物阻遏提高DNA克隆及组装效率的方法。本发明的方法是在原载体上设计两段DNA序列，将目标DNA片段与载体骨架序列隔开，两段DNA序列两侧分别设计有限制性内切酶位点，在进行DNA片段组装时，通过酶切，原载体会分为四部分，随后加入短链引物，短链引物会与原载体上添加的DNA序列中的一条链互补配对，经过该阻遏过程后，由于目的DNA片段的粘性末端与载体不匹配，被切下的目的DNA片段无法被连回原载体，有效的防止了酶切的DNA片段与原载体的自连的过程，因此提高了组装的效率。本发明的方法可以有效的减少克隆步骤、提高克隆效率以及DNA片段的组装效率等。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用短链引物阻遏提高DNA克隆及组装效率的方法。

背景技术

随着全基因组测序技术的普及以及DNA合成技术的发展，合成生物学得到飞速的发展。在合成生物学的很多研究领域，科学家们都需要合成大片段的DNA，而其中酿酒酵母基因组合成项目，甚至需要将DNA片段组装成染色体。因此探索DNA大片段的快速组装方法是当今的研究热点。

在过去的几十年中，酶切-连接是最常用的克隆方法。这种DNA重组技术始于限制性内切酶和DNA连接酶的发现，随后，多种多样的通过使用限制性内切酶和PCR等技术的连接DNA分子的方法被不断发展起来。然而，依赖于这些传统技术，待克隆或者拼接的序列本身需要存在限制性内切酶识别序列或者通过引入限制性内切酶识别序列来实现。这样不仅仅会增加操作的难度与限制，而且由于限制性内切酶识别序列的存在，会在新的序列中留下“疤痕”。因此，高效与高通量的克隆以及合成DNA的方法是当今合成生物学研究中的迫切需求。

不受序列限制的克隆的方法中包括不依赖于连接的克隆(LIC)、同时不依赖于序列和连接的克隆(SLIC)和Gibson assembly等。在近些年开发的DNA组装技术中，很多是利用DNA重组技术，比如利用酵母体内的同源重组系统进行DNA的体内组装。而Gibsonassembly是一个非常经典利用体外重组的方法，该方法基于5’外切酶、DNA聚合酶以及DNA连接酶，可以将多个有重叠序列的DNA片段在一个等温反应中进行组装。

Golden gate shuffling则是一种基于IIs型限制性内切酶的快速DNA组装技术。IIs型限制性内切酶的酶切序列和识别序列不同，目标DNA片段末端可以引入精心设计的IIs型酶位点，通过酶切，酶的识别序列与DNA片段分离，留下粘性末端，用于DNA多片段的无痕组装。然而在组装长片段DNA的过程中，不能忽视组装的效率，即有多少比例的DNA片段可以正确连接成目的长片段。提高该比率是任何一个新方法都必须面临的问题。以Goldengate DNA shuffling为例，研究者们通过不断优化反应体系中的各种参数来实现高效组装。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种阻遏环状质粒中的目的片段和骨架载体酶切后重新连接的方法。

本发明提供的阻遏环状质粒中的目的片段和骨架载体酶切后重新连接的方法包括如下步骤：

1)在环状质粒的目的片段两侧添加DNA片段甲和DNA片段乙，得到环状重组载体，所述环状重组载体从上游起依次包括所述DNA片段甲、所述目的片段、所述DNA片段乙和所述骨架载体；

所述DNA片段甲的两端分别为限制性内切酶A的识别切割序列和限制性内切酶B的识别切割序列，

所述DNA片段乙的两端分别为限制性内切酶C的识别切割序列和限制性内切酶D的识别切割序列；

用所述限制性内切酶A、所述限制性内切酶B、所述限制性内切酶C和所述限制性内切酶D酶切所述环状重组载体后形成的黏性末端依次记作：骨架载体黏性末端1、DNA片段甲上游黏性末端、DNA片段甲下游黏性末端、目的片段上游黏性末端、目的片段下游黏性末端、DNA片段乙上游黏性末端、DNA片段乙下游黏性末端、骨架载体黏性末端2；