[发明专利]一种特异性等温寡核苷酸探针的批量获取方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种基于全基因组序列的特异性等温寡核苷酸探针的批量获取方法。

背景技术

2011年5月中旬，德国暴发肠出血性大肠杆菌(EHEC)疫情，短短半个月时间，疫情在欧洲至少9个国家蔓延，震惊全世界。6月2日世界卫生组织(WHO)食品安全办公室对外宣布：导致最近德国肠出血性大肠杆菌(EHEC)疫情的致病菌是由两个不同的菌株变种而成的新型病菌(发生重组)，含致命基因(St一种特异性等温寡核苷酸探针的批量获取方法2毒力基因)，属于高传染性的有毒菌株，并且对部分抗生素具有抗药性。截止6月20日，已造成39人死亡，超过3000人受感染。这起疫情充分说明了：在未来可能出现的新的未知病原体将会在毒力、重组以及耐药性方面具有新的未知信息，给公共安全保障带来极大的威胁。

进入21世纪以来，全球人口数量不断增长、国际交流蓬勃发展、食物供应日趋全球化、生态环境遭到破坏、抗生素广泛使用、同时人类对环境的不断改造影响，造成了感染性疾病的病原微生物种类日益复杂，常见已知病原微生物的威胁不仅没有消除，而且出现了一些耐药性菌株，如葡萄球菌、肠球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌等，加之一些新发的新病原体的可能出现，给病原体的检测和鉴定带来了很大的困难。世界卫生组织(WHO)宣布：近30年来新发现了数十种新病原体，其中很多是由病原性细菌引发的传染性疾病；例如：肠出血性大肠埃希氏菌O157∶H7感染、O139血清型霍乱弧菌引起的霍乱、嗜肺军团菌引起的军团菌病、单核细胞李斯特菌引起的食物中毒、小肠结肠炎耶尔森氏菌感染等。

面对突如其来的疫情，我们必须尽快找出致病原因(不仅包括确定病原体种类，而且包括确定病原体的毒力特性、是否发生重组以及耐药性特点等)，以便确定治疗方案，及时采取有效的措施，防止疫情进一步恶化；同时也会为药物筛选、新药研发、后期预防等方面提供主要依据信息。对于已知病原体的快速鉴定技术目前世界上发展很快，其中基于微生物学、化学、分子生物学和免疫学理论发展起来的病原体快速检验方法可以分别对病原体进行快速检测鉴定。但是，这些常用的生化和免疫学检验都不能提供病原微生物的潜在的致病性信息或者相关毒性信息，同时这些基于微生物学、化学、分子生物学和免疫学理论发展起来的病原体快速检验方法多是一对一的检测方法，或是局限的一对多的方法。面对未来可能出现的新病原菌，它们都属于未知的病原体，为做到快速识别这些未知病原体，需要一对多的检测方法。生物芯片作为一种高通量技术，是当今全球医学检测和快速分析技术的热点研究领域之一。利用生物芯片技术可以开发“一对多”的病原体通用检测新技术，通过一次反应来检测多种病原体，结果快速、准确，它既能为突发事件的处置赢得时间，还可以为应对生物威胁的监测系统提供新的手段。

在进行芯片实验时，特异性的探针设计是决定基芯片检测效能的关键因素之一。在芯片设计过程中，探针主要是根据目的病原体靶基因中相对保守区域设计的，所以选择适用于芯片检测的靶基因对于制备基因芯片是至关重要的。全基因组芯片由单个病原体基因组构成，探针片段来自cDNA文库或病原体基因组的开放阅读框架。根据基因芯片的高通量性，把多个病原体的基因探针显微集成到同一芯片上，还可以实现对多个相关病原体的检测和鉴定。全基因组芯片利用特异性探针来鉴定病原体，进行系统分类，可实现对已知菌种特异性基因、毒力基因以及抗性相关基因的快速检测，还可以通过检测相关基因的可变性来研究病原体的遗传多样性，同时为获得相关毒力基因提供线索。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种基于全基因组序列的特异性等温寡核苷酸探针的批量获取方法。

为实现本发明的目的所采用的技术方案是：一种特异性等温寡核苷酸探针的批量获取方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)构建非致病性细菌蛋白质数据库；

(2)致病性细菌特有基因的生物信息学预测；

采用同源性比对的方法进行数据库中蛋白质的相似性比较；

(3)识别批量致病菌特有基因片段序列；

基于样本库减模式的相似性比对方法获得致病菌特有基因以及致病菌孤儿基因；

(4)获得批量致病菌特有指纹片段序列；

(5)获得批量致病菌特异性探针。

所述步骤(1)构建非致病性细菌蛋白质数据库是从NCBI基因组工程公布的已完成全基因组测序的细菌菌株中选取对人、动物和植物都不致病的非致病菌菌株，并且从NCBIGenBank获取非致病菌菌株的全基因组蛋白质序列来构建非致病性细菌蛋白质数据库。