[发明专利]嵌合内切核酸酶及其用途

权利要求书

1.由LAGLIDADG内切核酸酶和异源DNA结合结构域组成的嵌合内切核酸酶，其中所述LAGLIDADG内切核酸酶由与SEQIDNO:1、2或3所描述的多肽具有至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成并具有I-SceI酶活性，并且所述异源DNA结合结构域由Zn₂C₆锌指组成，所述Zn₂C₆锌指与SEQIDNO:71、72、73或74所描述的多肽具有至少95％氨基酸序列同一性，其中所述LAGLIDADG内切核酸酶不具有如下突变：I38S、I38N、G39D、G39R、L40Q、L42R、D44E、D44G、D44H、D44S、A45E、A45D、Y46D、I47R、I47N、D144E、D145E、D145N和G146E，并且其中所述异源DNA结合结构域具有图10所示的共有序列。

2.权利要求1所述的嵌合内切核酸酶，其中具有DNA双链断裂诱导活性的所述内切核酸酶和所述异源DNA结合结构域通过接头多肽连接。

3.权利要求1或2所述的嵌合内切核酸酶，其中所述接头多肽由至少3个氨基酸构成，并且其中，该接头多肽的氨基酸序列中至少三分之一的氨基酸是甘氨酸或丝氨酸或丙氨酸或甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸的组合。

4.权利要求1或2所述的嵌合内切核酸酶，包含NLS序列。

5.权利要求1或2所述的嵌合内切核酸酶，还包含SecIII或SecIV分泌信号。

6.编码权利要求1或2所述的嵌合内切核酸酶的经分离的多核苷酸。

7.权利要求6所述的经分离的多核苷酸，其中所述经分离的多核苷酸序列

a.是经密码子优化的，

b.具有低含量的RNA不稳定性动机，

c.具有低含量的密码子重复，

d.具有低含量的隐蔽剪接位点，

e.具有低含量的备选起始密码子，

f.具有低含量的限制性位点，

g.具有低含量的RNA二级结构，或

h.具有a)、b)、c)、d)、e)、f)或g)的任何组合。

8.表达盒，所述表达盒包含与启动子和终止子序列功能性组合的权利要求6所述的经分离的多核苷酸。

9.由嵌合识别序列组成的经分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列是SEQIDNO:13、14、15、16、43、44、45或46中任一所描述的多核苷酸序列。

10.原核生物，其包含：

a.编码权利要求1或2所述的嵌合内切核酸酶的多核苷酸，或

b.权利要求6或7所述的经分离的多核苷酸，或

c.权利要求8所述的表达盒，或

d.权利要求9所述的由嵌合识别序列组成的经分离的多核苷酸，或

e.a)、b)、c)和d)的任何组合。

11.权利要求10所述的原核生物，其中所述原核生物是大肠杆菌或农杆菌。

12.载体，其包含：

a.编码权利要求1或2所述的嵌合内切核酸酶的多核苷酸，或

b.权利要求6或7所述的经分离的多核苷酸，或

c.权利要求8所述的表达盒，或

d.权利要求9所述的由嵌合识别序列组成的经分离的多核苷酸，或

e.a)、b)、c)和d)的任何组合。

13.真菌细胞，其包含：

a.编码权利要求1或2所述的嵌合内切核酸酶的多核苷酸，或

b.权利要求6或7所述的经分离的多核苷酸，或

c.权利要求8所述的表达盒，或

d.权利要求9所述的由嵌合识别序列组成的经分离的多核苷酸，或

e.a)、b)、c)和d)的任何组合。

14.酵母细胞，其包含：

a.编码权利要求1或2所述的嵌合内切核酸酶的多核苷酸，或

b.权利要求6或7所述的经分离的多核苷酸，或

c.权利要求8所述的表达盒，或

d.权利要求9所述的嵌合识别序列组成的经分离的多核苷酸，或

e.a)、b)、c)和d)的任何组合。