[发明专利]一种检测镁或镁合金神经毒性的方法

说明书

技术领域

本发明属于金属离子毒性检测领域，具体是一种检测镁或镁合金神经毒性的方法。

背景技术

近年来，镁及镁合金作为可植入医用材料的研究发展迅猛，已经成为世界范围内新型生物材料研究的热点之一。镁合金有良好的力学性能，与人体骨密度接近；在体内完全可降解，可以减少二次手术对患者带来的痛苦；降解产生的镁离子是人体必需的阳离子之一，作为骨科植入材料、血管支架材料等有非常好的应用前景，最近还扩展到外科修复材料、口腔修复材料等领域。但是，镁合金也存在着降解速度过快，抗腐蚀性能偏低的问题。由此带来的主要问题是其快速降解产生的腐蚀产物是否有良好的生物相容性。目前的体外生物相容性研究主要集中成骨细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞和血液相容性，但是对于毒性更加敏感的神经细胞，却几乎没有报道。

虽然镁离子是人体内的第四大离子，体内的可耐受浓度很高。但是镁合金植入体内之后，降解速度较快，将导致植入体周围局部镁离子及其合金离子浓度突然升高，对周围神经存在潜在毒性。并且大量镁离子及其合金离子能够通过血液循环穿过血脑屏障，对中枢神经系统也存在潜在危害。而镁合金中其常见的合金元素铝，锌，锂，锰等都是已知的神经毒性物质。在镁及镁合金材料大量进入临床应用之前，研究其对神经细胞的影响非常有必要。不仅如此，有人提出将镁合金材料用作神经修复支架材料，并且初步动物实验证明了其可行性，因此在镁和镁合金材料大量进入临床应用之前，非常有必要研究其对神经细胞的潜在影响。

根据ISO10993以及GB/T16886规定，生物材料细胞毒性的检测方法有直接接触法和浸提法。镁合金材料在植入体内之后会产生电化学腐蚀，有剧烈的化学反应并伴随着pH值升高和氢气产生，研究表明镁合金材料不适用直接接触法，而需要采用浸提法。

MTT法是目前应用最为广泛的细胞活性研究方法，但是MTT法干扰因素较多，容易造成实验结果不够稳定。

体外培养的神经细胞可以自发的形成神经网络并且产生稳定的电生理信号。微电极阵列（MEA）是最近发展起来的可以非侵入性的、实时的、长期的检测神经电生理信号的技术。将体外培养的神经网络和微电极阵列结合形成的生物传感器近年来被广泛用于药物和化合物质的电生理神经毒性的检测。由于MEA生物传感器可以实现高通量，高输出的检测，并且其得到的检测结果跟体内试验有很好的一致性，被称作“二十一世纪生理学神经毒性的检测平台”。虽然MEA已经广泛用于药物的神经生理学检测，但是对于生物材料的检测还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种结果稳定的检测镁或镁合金神经毒性的方法。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测镁或镁合金神经毒性的方法，所述方法包括：用LDH法检测细胞活性；以及，用鸡胚前脑神经元-微电极阵列生物传感器检测神经网络电生理信号。

进一步地，所述用LDH法检测细胞活性包括以下步骤：

S1、配制镁离子溶液、制备镁或镁合金的浸提液；

S2、用Neurobasal培养液培养鸡胚前脑神经元；

S3、往鸡胚前脑神经元加入镁或镁合金的浸提液，用LDH检测细胞活性。

进一步地，所述S1具体为：

S11、将镁或镁合金的试样置于密封的离心管，加入Neurobasal培养液浸提；

S12、24h后取出试样，浸提液离心后取上清；

S13、检测浸提液的pH值和镁离子浓度；

S14、浸提液经滤膜过滤、稀释后保存备用。

进一步地，所述S2具体为：

S21、种细胞前一天，将96孔板铺上聚乙烯亚胺；

S22、获取鸡胚前脑组织，用EDTA胰酶消化，再吹打成单细胞悬液，然后离心弃去上清，加M199培养液制成细胞悬液，并加入96孔板，置于培养箱；

S23、24h后将M199培养液全部换成Neurobasal培养液；

S24、第3天加入阿糖胞苷。

进一步地，所述获取鸡胚前脑组织具体为：

S221、取第7~9天的受精鸡蛋，消毒，用镊子将鸡蛋头部敲碎，去壳，拨开壳膜，取出鸡胚放到装有HBSS的培养皿；

S222、用镊子将鸡胚的头截断，放入另一个有HBSS的培养皿；

S223、加鸡胚的头部背面朝上置，压住中脑部位，并把前脑的脑膜揭开，取出两团白色的组织，放于有HBSS的培养皿，将贴附在白色组织外面残余的脑膜去掉，得到鸡胚前脑组织。