[发明专利]角度双加氧酶基因dpeA1A2及其应用

说明书

本发明公开了角度双加氧酶基因dpeA1A2及其应用。一种角度双加氧酶基因dpeA1A2，其由SEQ ID NO.1所示的大小为1383bp的角度双加氧酶大亚基编码基因dpeA1、SEQ ID NO.2所示的大小为561bp的角度双加氧酶小亚基编码基因dpeA2以及二者之间的连接序列GATG组成。本发明提供的DpeA1A2BC全酶能在72hr内完全降解100mg/L的二苯醚；此外DpeA1A2BC全酶还能在72hr内完全降解100mg/L的2‑苯氧基苯甲酸(2‑PBA)。因此角度双加氧酶基因dpeA1A2在构建降解二苯醚或2‑苯氧基苯甲酸转基因作物中应用。DpeA1A2BC全酶在降解二苯醚和2‑PBA中应用。

技术领域

本发明属于应用环境微生物和农业领域，涉及角度双加氧酶基因dpeA1A2及其应用。

背景技术

化学农药是保障我国农业大丰收的重要手段之一，在农业生产中有非常重要的作用。农药是指应用于防治危害农作物的病虫、杂草等有害生物以及调节植物生长的化学试剂的总称。但是，由于长期以来剧毒、高残留、难降解农药的大量使用，我们面临着不断增加的土壤、地下水和大气农药污染的环境问题。而很多农药都是由中间体合成的，所以降解农药中间体具有广适性和高效性。农药污染降解技术可分为热降解、光降解、化学降解和生物降解。生物降解就是通过生物的作用将农药分解为小分子无毒或低毒化合物，并最终降解为水。其中微生物修复技术具有效率高、效果好、更绿色等特点，是农药修复技术的最好方法。

二苯醚和2-苯氧基苯甲酸(2-PBA)和常见的农药除草剂的中间体，也是重要的化学合成工业中间体。其衍生物和卤素取代物可以合成除草剂、杀虫剂等农药和药品等化工产品。获得二苯醚和2-PBA降解菌株和降解基因在治理除草剂残留，消除其药害技术研发中具有以下作用和功能,(一)通过现代生物工程技术将降解基因导入作物构建相应的除草剂抗性转基因作物，(二)通过现代微生物发酵技术将二苯醚和2-PBA农药中间体降解菌株和基因制成降解菌剂或酶制剂可以将土壤中二苯醚和2-PBA残留降解。此外，二苯醚和2-PBA降解基因还可用于化工染料中间体以及药物合成的生物转化，以及二苯醚化合物污染的生物修复。因此二苯醚和2-PBA降解基因在消除该类除草剂中间体药害、环境污染生物修复及生物转化领域中具有非常重要的理论和应用价值。

角度双加氧(Angular dioxygenase)是一种微生物特有的降解某些具有角度结构的芳烃污染物(如二噁英、咔唑、芴、二苯并噻吩、二苯醚类和二苯并呋喃等化合物)的方式。这些化合物的苯环上有一个C原子上连接了O、N原子(芴和二苯并噻吩连接的是C)，形成一个夹角，因此这个C原子叫角度C原子。

催化二苯醚类化合物3‐苯氧基苯甲酸(3‐PBA)醚键断裂的角度双加氧酶目前共报道了两个。一个是Pseudomonas pseudoalcaligenes POB310中的PobAB，属于I‐型Rieske非血红素铁氧化酶(Rieske non‐heme iron oxygenase,RHO)(Kweon et al.,2008)，有2个组份：一个末端氧化酶和一个FNR_C‐型还原酶(Dehmel et al.,1995)，PobAB攻击二苯醚类化合物3‐PBA的苯甲酸部分的1,6位碳原子，导致醚键断裂生成苯酚和原儿茶酸(见图1)。另一个是从Sphingobium wenxiniae JZ‐1中发现的PbaA1A2BC，属于IV‐型RHOs，有3个组分：一个末端氧化酶，一个[2Fe‐2S]‐型铁氧还蛋白和一个GR‐型还原酶(Wang et al.,2014)，PbaA1A2BC攻击3‐PBA的苯部分的1′,2′位碳原子，导致3‐苯氧基苯甲酸的醚键断裂生成邻苯二酚和3‐羟基苯甲酸(见图2)。