[发明专利]一种高纯度京尼平的结晶方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是涉及一种高纯度京尼平的结晶方法。

背景技术

京尼平是源于栀子果实中的环烯醚萜苷-京尼平苷。它主要用于传统中药，以缓解II型糖尿病的症状。京尼平（Genipin）是一种很好的蛋白质、胶原、明胶和壳聚糖的天然交联剂。鼠静脉注射（LD50）的实验表明它是低急性毒性，因此，毒性远低于戊二醛和许多其他常用交联剂。与其他材料的交联可用于制作生物材料，如人造骨骼、伤口包扎材料等。它也可用于制药，如肝脏疾病控制，降压，通便；用做指纹采集试剂；也可用作固定化酶和控释药物的交联剂。

目前，京尼平的制备方法主要有提取法和生物法。提取法是直接从植物组织（如栀子果实）中提取分离京尼平苷，再用β-葡萄糖苷酶水解，然后用乙醚萃取、真空浓缩、重结晶而制得。但由于京尼平活性高，在自然界中很少独立存在（桅子果实中的含量也仅为0.005～0.01%），因此直接提取法不仅工艺复杂，且提取率低。生物法是以京尼平苷为底物，经酶水解糖苷键得到京尼平。由于该方法反应路线短，反应条件温和，且栀子苷来源丰富，因此生物法已成为京尼平制备的主要技术路线。但是目前生物法得到的京尼平一般纯度都不是很高，因此制备出高纯度的京尼平是目前研究的重点和难点。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种高纯度京尼平的结晶方法，以制备纯度高的京尼平。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。

一种高纯度京尼平的结晶方法，包括以下步骤：

（1）纤维素酶液的制备：将纤维素酶固体加入到pH为5.0～5.2的缓冲溶液中，使纤维素酶的浓度为4～10%，然后置于50℃下超声提取30min后，经抽滤得到酶液；

（2）京尼平溶液的制备：按京尼平苷占酶液质量的2～5%，在京尼平苷中加入步骤（1）所得酶液，再置于50℃恒温水浴锅中，发酵反应1.5～2h，取出冷却后即得到京尼平溶液；

（3）京尼平的粗分离：按无水乙醇与京尼平溶液的体积比为（1～2）:（1～2），在步骤（2）所得京尼平溶液中加入无水乙醇溶液中，使之充分混匀，然后经抽滤去除不溶物，得京尼平粗溶液，将其真空干燥得到京尼平粗粉末；

（4）京尼平的萃取纯化：按京尼平粗粉末与有机溶剂的固液比g/mL计为1:（10～100）；将步骤（3）所得京尼平粗粉末加入有机溶剂中进行超声萃取数次，合并萃取液，再在萃取液中加入活性炭进行超声脱色，经过滤后，将滤液旋转蒸发浓缩至原滤液体积的3～5%，取出置于常温条件下进行结晶，即得到高纯度的京尼平。

所述步骤（1）的缓冲溶液为乙酸钠:乙酸或磷酸氢二钠:柠檬酸的体积比为3～8:2～10:1～6的混合溶液。

所述步骤（4）的有机溶剂为无水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、乙醚中的任意一种。

所述步骤（4）的活性炭加入量是占萃取液的1～2%。

本发明是在生物法制备京尼平的基础上，用重结晶来精制纯化以得到高纯度的京尼平，纯度达到98%以上。且该结晶方法比文献报道过的结晶方法更简单易得，不需要昂贵的仪器试剂，所用试剂低毒性，不污染环境，适用于高纯度京尼平的制备。

相对于现有技术，本发明具有以下显著优点：

1、本发明利用京尼平易溶于无水乙醇等有机溶剂的特点，用无水乙醇提取发酵后得到的京尼平粗品，然后又用乙酸乙酯等有机溶剂萃取京尼平粗品，结晶得到高纯度的京尼平，这样达到了双重萃取的目的，京尼平萃取率增加，而且结晶得到的京尼平纯度也很高；目前常规生物法得到的京尼平一般纯度都不是很高，原因分析是含有栀子苷或者天然色素类物质导致的；本发明均能有效克服；

2、利用乙酸乙酯等有机溶剂来萃取京尼平粗品，然后结晶，它有很强的专属性，因此不会产生干扰；

3、此种工艺简单、对设备要求不高、投资成本低、经济效益高。

4、结晶条件是常温，也不会产生任何环境污染，操作简单。

附图说明

图1为本发明步骤（2）的化学反应式。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步地说明，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例1

（1）纤维素酶液的制备：将40g纤维素酶固体加入到pH为5.1的缓冲溶液中，使纤维素酶的浓度为4%，然后置于50℃下超声提取30min后，经抽滤得到酶液；其中缓冲溶液为乙酸钠:乙酸:柠檬酸的体积比为5:8:3的混合溶液；