[发明专利]促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome的制备及应用

说明书

技术领域

本发明涉及皮肤创伤修复的技术领域，尤其涉及一种促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞的多因子载体exosome的制备，本发明还涉及这种多因子载体制成的溶剂或针剂，以及这种多因子载体和溶剂或针剂的应用。

背景技术

皮肤软组织损伤是日常生活中常见的一种创伤；目前常用的皮肤软组织损伤治疗主要是通过全身支持治疗，创面的清理以及新型敷料和皮肤移植等方法，传统的治疗方法虽然有一定的效果但愈合时间快慢难于把握，瘢痕大小，皮源紧张和易感染的问题有待解决。

近年来，以干细胞特别是以间充质干细胞(MSC)(脂肪干细胞是间充质干细胞中的一种，相比其他间充质干细胞脂肪干细胞拥有取材方便，无伦理学限制等优势)为基础的皮肤再生医学研究得到广泛关注，研究表明MSC对组织损伤有良好的修复作用，尽管其机制尚未完全阐明，但初步结果显示可能与损伤的刺激及局部创面微环境中各种细胞因子有关，它们通过促进MSC趋化以及诱导MSC向所需要的组织或细胞分化来参与损伤组织的修复，因此在组织的修复中具有临床应用前景。然而，MSC植入体内后存在长期应用安全性问题以及储存和运输困难等问题极大的限制其临床应用。

随着研究的深入发现MSC发挥组织损伤修复的一个重要机制是旁分泌效应，在促进创面愈合过程中比细胞转分化起的作用更大。其旁分泌中最有效的活性成分是MSC分泌的exosome，在细胞信息传递中起着非常重要的作用，这一机制的提出为基于各种来源MSC的非细胞治疗奠定了重要基础。

微囊泡结构exosome是近年来发现的细胞间信号通讯的重要途径，通过细胞外多胞体(MBV)分泌到胞外，是细胞可溶性细胞因子外的重要旁分泌形式，exosome的特征主要有：(1)直径为30-100nm；(2)具有来源细胞的胞质和脂质膜成分；(3)含有来源细胞特异性蛋白以及相关蛋白如CD63，CD9，CD81等。exosome成分主要包括：microRNA、mRNA，蛋白等，研究表明不同来源的exosome的组成亦有差异，说明其功能的复杂性。由此可见，作为非细胞治疗的重要成分，exosome在促进皮肤损伤修复中具有重要作用。MSC分泌的exosome与MSC相比具有许多优势：(1)exosome通过细胞内吞作用摄入细胞，可以避免一些大分子(如蛋白质，RNA)因细胞膜通道阻挡而不易被细胞吸收的问题，具有生物活性高，作用效率高的优点；(2)exosome在-80℃长期稳定保存，携带的含有生物活性的有效成分受exosome脂质膜保护，不易被破坏，且便于运输和储存；(3)易于掌握临床应用时间，亦易于控制使用浓度、剂量及途径；(4)克服了MSC在体内存活率低及长期应用突变致瘤的潜在隐患；(5)由于其体积小避免了强烈的免疫排斥等并发症。

因此，MSC来源的exosome在组织损伤修复中的作用及机制研究就显得特别重要，特别是将脂肪干细胞分泌的exosome进行提取纯化的研究更具有重要的意义。

发明内容

针对上述问题中存在的不足之处，本发明提供促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome的制备及应用。

为实现上述目的，本发明公开了促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌多因子载体exosome的制备方法，该方法包括：

步骤一、取处于对数生长期的第三代到第六代的人脂肪干细胞，待细胞融合至80％后，弃去原培养液，用磷酸盐缓冲液冲洗2-3遍后，换无血清培养液培养，24h后收集培养上清液；

步骤二、将步骤一中收集的上清液，在温度4℃、离心力3000g下离心15分钟，离心去除细胞碎片和悬浮细胞，离心后的上清液经0.22um孔径的无菌滤膜过滤得到脂肪干细胞条件培养液；

步骤三、将步骤二中的条件培养液放入分子量为100KDa超滤离心管中，在温度4℃、离心力1000g下离心30分钟，离心浓缩，得到含有exosome的浓缩液；

步骤四、将步骤三中的浓缩液与Exoquick-TC试剂按照5:1的体积比混合，震荡混匀后，4℃孵育过夜；

步骤五、孵育过夜后的混合液在温度4℃、离心力1500g下离心30分钟，弃去上清液保留沉淀；

步骤六、在温度4℃、离心力1500g下对沉淀离心5分钟，吸净残余液体后，用磷酸盐缓冲液重悬，经0.22um孔径的无菌滤膜过滤后-80℃保存，即得多因子载体exosome。

作为本发明的进一步改进，在步骤一中，所述原培养液内各成分的体积为：88％人脂肪干细胞专用基础培养基、10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素、1％谷氨酰胺。