[发明专利]用于检测和定位猪瘟病毒的探针以及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及动物分子病毒学领域，特别是涉及一种用于检测和定位猪瘟病毒的探针以及试剂盒。

背景技术

猪瘟(ClassicalSwineFever,CSF)是由黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus,CSFV)引起的猪的高度致死性、接触性传染病。1885年首先发现于美国，以后传播到世界各大洲，中国大部分省份都有发生。根据OIE制定的《陆生动物卫生法典》第五版，CSF被列为必须报告的动物疫病之一，在我国被列为“一类动物疫病”。我国猪瘟兔化弱毒苗(HogCholeraLapinizedVirus,HCLV)已广泛地应用了半个世纪，有效地控制了CSF大流行和急性发生，但是CSFV依然存在于亚洲、欧洲和中南美洲等世界大多数区域，造成了养猪业的极大损失。

当前国内外致力于CSFV在各器官中的定位和复制情况研究，但是电子显微镜和免疫组化方法只能检测成熟病毒粒子，而无法定位病毒RNA且检测灵敏性低无法实现精确定量；RealtimeRT-PCR方法能对CSFVRNA总量进行检测但无法在细胞或亚细胞水平上进行CSFVRNA定位。因此，上述方法均未能有效获得CSFVRNA复制和增殖变化的详细动态过程。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种用于检测和定位猪瘟病毒的探针以及试剂盒，具有高敏感性和稳定性的特点，克服了传统荧光原位杂交法信号基团强度低，检测灵敏度差的劣势。

基于上述目的，本发明提供的用于检测和定位猪瘟病毒的探针包括5条针对猪瘟病毒的特异性探针序列：

P1：5’-GGGACTAGCCGTAGTGGCGAGCTCCCTG-3’；

P2：5’-GAGTACAGGACAGTCGTCAATAGTTCG-3’；

P3：5’-CAAGCCCAGAGGTACGGTATAGAAGACGGGATAAATATCAC-3’；

P4：5’-CTAGTTACATGCCGGGGAGAAATACAACCACAATCCTAG-3’；和

P5：5’-GTTAGATTCCAGTGGTGAGAGGGGTACCATAGCATATG-3’。

在本发明的一些实施例中，所述5条针对猪瘟病毒的特异性探针都标记红色荧光基团。

在本发明的一些实施例中，所述红色荧光基团选自Cy3基团、ROX基团、TexasRed基团和LCRED640基团中的至少一种。

在本发明的一些实施例中，还包括1条针对猪内参基因β-actin的特异性探针序列：

5’-GGTATGGAATCCTGTGGCATCACGAAACTACCTTCAACTCAATC-3’。

在本发明的一些实施例中，所述1条针对猪内参基因β-actin的特异性探针标记FITC绿色荧光基团。

在本发明的一些实施例中，所述绿色荧光基团选自FAM基团或者FITC基团。

本发明还提供一种试剂盒，包括上述用于检测和定位猪瘟病毒的探针。

从上面所述可以看出，本发明提供的用于检测和定位猪瘟病毒的探针可用于对猪瘟病毒进行检测和定位，尤其适用于基于QuantiGeneViewRNA原位杂交技术的检测。本发明基于QuantiGeneViewRNA技术的新型CSFVRNA原位杂交检测技术，能够特异、敏感、快速、简便地从培养细胞、组织和临床样本中对目标RNA进行检测和定位，可以清晰地可视化检测和定位猪瘟病毒RNA，从而在RNA水平上对CSFV感染过程中病毒RNA的复制、增殖规律进行阐述，为对比急性感染和慢性感染靶细胞类型的差异提供了重要的技术平台，同时对明确CSFVRNA富集样品的临床采集提出指导意见。

附图说明

图1为采用本发明实施例的探针进行原位杂交检测建立的结果图，其中红色亮点为CSFVRNA染色结果；绿色亮点为β-actin染色结果；蓝色亮区为细胞核染色结果；

图2A、2B分别为采用本发明实施例的探针进行原位杂交检测BVDV、PRV、PCV-2以及Shimen(1.1亚型)、SXDT1/2011(2.1亚型)、HeBHH1/95(2.2亚型)、HeNBY1/96(2.3亚型)、HCLV(1.1亚型)的特异性的结果图；

图3为使用CSFVQuantiGeneViewRNA原位杂交检测法、CSFV单抗免疫荧光法和CSFV免疫组化法进行检测的结果图；

图4为采用本发明实施例的探针进行多次重复原位杂交检测建立的结果图。

具体实施方式