[发明专利]一种杜仲几丁质酶编码基因（EuCHIT1）及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域,主要关于杜仲抗真菌几丁质酶(EuCHIT1)及编码基因与应用。

背景技术

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)是杜仲科杜仲属植物雌雄异株，在我国被利用的历史可以追溯到公元二世纪的《神农本草经》，具有双向调节血压、抑菌和抗菌效用，具有重要的药用价值。鉴于其起源古老，在科学上具有重要的研究价值，目前对杜仲的研究主要集中在血压调节物质，杜仲胶合成途径相关基因的克隆和抗菌物质的化学分离方面。早期研究表明从杜仲中提取的总蛋白对多种植物病源真菌的生长具有明显的抑制作用，并且从中分离到的杜仲抗菌肽EAFP1和EAFP2含有几丁质结合结构。几丁质酶广泛的存在于动植物及微生物的细胞和组织中，以几丁质为底物将其水解成寡聚糖再进一步水解为N－乙酰氨基葡萄糖，高等植物不含作为真菌细胞壁组分之一的几丁质，但当植物受到真菌、细菌和病毒等感染时，植物几丁质酶的转录表达量迅速提高。因此普遍认为几丁质酶是植物重要的病程相关蛋白(pathogenesis-relatedprotein，PR)。目前多种植物的几丁质酶基因序列被克隆，如白杨、蚕豆、小麦、水稻、甜菜、烟草、马铃薯、棉花等，但对杜仲几丁质酶基因的研究尚未见报导

发明内容

针对上述领域中的空白，本发明提供一种杜仲几丁质酶，对植物真菌病害的防治有明显的作用。

本发明的目的之一是提供一种杜仲几丁质酶。

本发明另一目的是提供编码上述杜仲几丁质酶的基因序列。

本发明另一目的是提供上述杜仲几丁质酶的编码基因在植物基因工程中的应用。

杜仲几丁质酶(EuCHIT1)，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

编码上述杜仲几丁质酶的基因。

所述编码杜仲几丁质酶的基因序列如SEQIDNO：1所示。

杜仲几丁质酶的表达载体，含有编码上述杜仲几丁质酶的基因。

所述表达载体的骨架载体为pSH-35S。

杜仲几丁质酶的生产方法，将编码杜仲几丁质酶的基因转化植物，使其表达杜仲几丁质酶，利用生物反应器生产杜仲几丁质酶，再提取得到。

所述转化为将上述表达载体转化根瘤农杆菌LBA4404，遗传转化烟草。

杜仲几丁质酶的编码基因在植物基因工程中的应用。

所述应用为将编码杜仲几丁质酶的基因转化植物，使植物表达对真菌病害的抗性；或者所述应用为将杜仲几丁质酶作为药效成分制成药剂用于防治真菌病害。

所述真菌为镰刀菌或灰霉菌。

本发明提供一种杜仲几丁质酶及其编码基因与应用，根据已经构建的杜仲转录组注释的几丁质酶基因部分序列,设计RACE扩增引物，提取杜仲的总mRNA反转cDNA为模板，扩增基因的5’端和3’端序列，经过overlap拼接获得全基因序列，根据拼接结果设计开放阅扩增引物。开放阅读框编码的氨基酸序列，经过NCBI同源比对后发现与刺槐的几丁质酶的同源性为84％。在对几丁质酶基因进行生物信息学分析基础上，构建植物表达载体遗传转化烟草。提取烟草总蛋白进行抑菌试验发现与野生型烟草相比，该转基因烟草对镰刀菌这一植物病原真菌的生长具有抑制作用，故该基因可以用于对植物真菌病害的防治中。

附图说明

图1是本发明实施例1中杜仲几丁质酶基因5’-RACE和3’-RACEPCR产物电泳图；

图2是本发明实施例1中杜仲几丁质酶几丁质结合和催化位点预测图；

图3是本发明实施例1中杜仲几丁质酶磷酸化位点预测图；

图4是本发明实施例1中杜仲几丁质酶信号肽预测图；

图5是本发明实施例1中杜仲几丁质酶进化树分析图；

图6是本发明实施例1中杜仲几丁质酶基因开放阅读框PCR扩增图；

图7是本发明实施例1中杜仲几丁质酶遗传转化烟草过程图；

图8是本发明实施例1中转杜仲几丁质酶烟草蛋白提取物体外抑菌试验图(镰刀菌)；

图9是本发明实施例1中转杜仲几丁质酶烟草蛋白提取物体外抑菌试验图(灰霉菌)。

具体实施方式

为了更为清楚的解释本发明的目的和技术方案以及优点，结合附图对本发明进一步详细的说明。此处描述的具体的实施方法仅仅用以解释本发明。

本实验使用贵州农业生物工程重点实验室试验示范基地种植10余年生杜仲为材料，采集雌雄株幼芽、叶片、幼枝、树皮及雌株幼果提取总RNA，反转cDNA。