[发明专利]一种透明质酸修饰的多级纳米颗粒及其制备与应用

权利要求书

1.一种透明质酸修饰的多级纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1、使用乙醇、氨水、TEOS制备不同粒径的一级二氧化硅颗粒，其中第一级二氧化硅颗粒的粒径范围为10-60nm、第二级二氧化硅颗粒的粒径范围为100-500nm、第三级二氧化硅颗粒的粒径范围为0.85-3.5μm；

步骤2、将步骤1中得到的所述一级二氧化硅颗粒在乙醇溶液中超声，直到所述一级二氧化硅颗粒分散均匀；

步骤3、将步骤1中得到的所述第二级二氧化硅颗粒用3-氨丙基三乙氧基硅烷在甲苯溶液中进行氨基化修饰，然后将氨基化修饰后的所述第二级二氧化硅颗粒与所述第一级二氧化硅颗粒加入超纯水中，并在20-100摄氏度下反应12-24小时，以制备二级二氧化硅颗粒；

步骤4、将步骤1中得到的所述第三级二氧化硅颗粒和步骤3中得到的所述二级二氧化硅颗粒分别与3-氨丙基三乙氧基硅烷在甲苯溶液中进行氨基化修饰，然后将氨基化修饰后的所述第三级二氧化硅颗粒与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入到富马酸二甲脂溶液中，在20-65摄氏度下反应2-5小时，再加入氨基化修饰后的所述二级二氧化硅颗粒，在20-65摄氏度下进行酯化反应，以制备三级二氧化硅颗粒；

步骤5、将步骤4中得到的所述三级二氧化硅颗粒与3-氨丙基三乙氧基硅烷在甲苯溶液中进行氨基化修饰，然后将氨基化修饰后的所述三级二氧化硅颗粒与丁二酸酐加入到富马酸二甲脂溶液中进行羧基化修饰，然后将羧基化修饰后的所述三级二氧化硅颗粒与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入到富马酸二甲脂溶液中，在20-65摄氏度下反应2-5小时，再加入粒径范围为0.5-1mm的玻璃颗粒进行酯化反应，制备四级二氧化硅颗粒；

步骤6、将步骤1至5中得到的所述一级二氧化硅颗粒、所述二级二氧化硅颗粒、所述三级二氧化硅颗粒和所述四级二氧化硅颗粒分别与3-氨丙基三乙氧基硅烷在甲苯溶液中进行氨基化修饰，然后将透明质酸与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺及N-羟基琥珀酰亚胺加入到富马酸二甲脂溶液中，在20-65摄氏度下反应2-5小时，再加入氨基化修饰后的所述一级二氧化硅颗粒、所述二级二氧化硅颗粒、所述三级二氧化硅颗粒和所述四级二氧化硅颗粒进行酯化反应制备表面经所述透明质酸修饰的多级纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，用于制备所述四级二氧化硅颗粒的所述一级二氧化硅颗粒的优选为：第一级二氧化硅颗粒的粒径范围为10-20nm，第二级二氧化硅颗粒的粒径范围为150-200nm，第三级二氧化硅颗粒的粒径范围为0.85-1.5μm。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氨基化修饰的反应温度为80-120摄氏度，回流反应时间为10-24小时；所述羧基化修饰的反应温度为20-60摄氏度，反应时间为12-24小时；所述酯化反应的反应温度为20-65摄氏度。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的制备方法制备的多级纳米颗粒在质谱检测生物样品中的应用，其特征在于，所述多级纳米颗粒为一级以上的多层二氧化硅颗粒，所述多级纳米颗粒具有粗糙表面，所述多级纳米颗粒的外表面由透明质酸修饰，所述多级纳米颗粒的粒径小于等于1mm。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述透明质酸修饰的多级纳米颗粒用于富集癌细胞蛋白以用于质谱检测。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述癌细胞蛋白为CD44受体蛋白。

7.一种从血清中富集CD44受体蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1、根据权利要求1所述的方法制备透明质酸修饰的多级纳米颗粒；

步骤2、稀释血清样品，加入步骤1中制备的所述透明质酸修饰的多级纳米颗粒，充分混合，得到富集后的所述CD44受体蛋白。

8.一种利用质谱检测血清中的CD44受体蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1、仪器与试剂的准备：激光解析电离质谱，采用线性反射模式，正离子检测；

步骤2、根据权利要求7所述的方法从血清中富集所述CD44受体蛋白；

步骤3、离心分离得到上清液，进行胰蛋白酶处理；

步骤4：将处理后的样品在质谱靶板上点样，室温下干燥，采用内标法对血清样品中的小分子进行定量分析检测；

步骤5：对质谱检测结果进行分析，得出结论。