[发明专利]一种黑果菝葜初代诱导及离体保存的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物初代诱导及离体保存的方法，特别是一种黑果菝葜初代诱导及离体保存的方法。

背景技术

黑果菝葜(Smilaxglauco-chinaWarb.)又名金刚藤头，为百合科(Liliacea)菝葜属(SmilaxL.)攀援灌木，根、茎入药，其味甘，性平，具有祛风，清热，利湿，解毒的功效。根状茎粗短且富含淀粉，可以用于制做糕点、酿酒或加工食用。春、夏季采收的嫩叶可鲜用，含有丰富的蛋白质、氨基酸和多种维生素，而且具有清热解毒的药膳功效，为不可多得的药食两用的植物。

黑果菝葜主要分布于我国的甘肃(南部)、陕西(秦岭以南)、山西(南部)、河南、四川(东部)、贵州、湖北、湖南、江苏(南部)、浙江、安徽、江西、广东(北部)和广西(东北部)等地，生于海拔1600m以下的林下、灌丛或山坡上。黑果菝葜的繁育特性主要是靠自然分蘖或实生繁殖，但每株的年分蘖能力低，研究发现百合科的种子休眠期长且发芽率低，扦插和嫁接比较难成活。近几年来，由于人们的过度的采挖，该植物资源面临更严峻的境况。鉴于黑果菝葜良好的药用价值和面临的资源困境，为了更好的开发和保护黑果菝葜中药资源，本发明对黑果菝葜优良植株初代诱导和离体保存进行了探讨和研究，将有利于该野生资源的保护和优良性状的保持，为进一步综合开发黑果菝葜创造条件。

发明内容

本发明的目的是提供一种黑果菝葜初代诱导及离体保存的方法，通过对黑果菝葜进行外植体消毒诱导、增殖、生根及离体保存试验，筛选出最佳外植体消毒方法、适宜离体保存的生长调节剂及浓度。它能够提高初代诱导率，延长继代周期，减少工作量和成本，保证无菌苗的优良性状。

本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种黑果菝葜初代诱导及离体保存的方法，包括以下步骤：

(1)外植体的消毒：将3～5滴洗洁精滴入装有100ml自来水的烧杯中，取无病虫害黑果菝葜当年生的幼嫩带芽茎段剪切成4cm长的带芽茎段，置于烧杯中搅拌，再用软毛刷擦拭表面污垢，流水冲洗15min，然后在超净工作台内用75v/v％的乙醇消毒15S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl₂消毒10min，无菌水浸泡3次，每次约2min，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；

(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体剪切成1～1.5cm的带芽茎段，接种于MS启动培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下进行暗培养10d开始萌发，发育成不定芽,所述MS启动培养基是以MS为基本培养基，还加入0.5～2.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0～1.0mg/L的吲哚丁酸IBA和0～2.0mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；

(3)无菌芽的继代增殖：将步骤(2)中得到的不定芽剪切成1～2cm长的单芽或芽丛接种于MS继代增殖培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下培养30～40d便长出更多的芽丛，所述继代增殖培养基为MS基本培养基，添加0.1～3.0mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.5～2.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1～2.0mg/L的吲哚乙酸IBA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；

(4)无菌苗的生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养15～20d获得生根苗,所述1/2MS生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入0～1.0mg/L的萘乙酸NAA、0～1.0mg/L的吲哚丁酸IBA，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；

(5)无菌苗的保存：将步骤(4)中得到的生根苗置于离体保存培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下进行离体保存，所述离体保存培养基是以MS为基本培养基，还加入0.05～0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.05～0.1mg/L的萘乙酸NAA、0.5～2.0mg/L的PP333，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。

本发明的突出优点在于：