[发明专利]一种检测复烤烟品种混杂的方法

说明书

本发明涉及一种检测复烤烟品种混杂的方法。其技术方案是包括以下步骤：（1）复烤烟DNA的提取：（2）引物合成：（3）简单重复序列间多态性‑聚合酶链式反应：用ISSR引物826或者ISSR引物856在待检测的复烤烟中进行ISSR‑PCR；（4）比对标准图谱：将待检测的复烤烟ISSR‑PCR电泳后的成像照片与标准指纹图谱进行条带比对，如果条带能够吻合即为相应的品种之一，如果不能吻合即为混杂品种，检测完毕。有益效果是：为复烤烟的鉴定与检测提供了方法，在其它复烤烟的实验过程中可以直接参考本实验所筛选得到的引物和相应的退火温度直接进行ISSR‑PCR反应，进而得到相应品种的指纹图谱作为后续比对的标准谱带。

技术领域

本发明涉及一种复烤烟的检测方法，特别涉及一种检测复烤烟品种混杂的方法。

背景技术

烤烟就是将植物进行第一次加工后的原材料，复烤烟就是把烟叶从农产品整理加工成工业原料的准备性过程，是烟叶调制后的又一次干燥所以称为复烤。在烟叶复烤加工的过程中要将霉变和不符合等级的烟叶剔除掉以保证复烤烟的质量。在加热干燥的同时能够将烟叶的害虫杀死，复烤过的烟叶水分的含量很低利于长期贮存醇化或者人工发酵。打叶复烤是为卷烟企业提供优质原料的关键环节。目前，烟厂向农户收购的是复烤烟。而复烤烟在一系列加工过程中，品种间的外观品质差异缩小，为了保证后续香烟的品质，亟待科学的检测方法。

例如：在云南地区，由于烤烟的大量调出及品种的单一、老化，造成云产卷烟品牌与省外品牌在产品风格上出现同质化，使得云产卷烟的原料优势正逐渐消失。红云红河集团原料差异化项目的实施，就是从新品种选育和国外品种引进两方面着手，一定程度上改善了这种状况，由于不同烟叶品种在卷烟配方中所起作用不同，因而需要对烟叶品种进行鉴别。到目前为止，对于烟叶品种间差异性的鉴定，仅依据烟叶外观质量进行评价，在烟叶生产、收购、复烤、仓储过程中，并未形成一套科学的跟踪监测体系，导致品种混杂、错标等现象，严重影响了云产卷烟产品质量和风格的稳定性，如：红花大金元、云87、NC297、NC102、K326等五种云产品牌卷烟主体烟叶原料复烤烟。

发明内容

本发明的目的就是针对现有技术存在的上述缺陷，提供一种检测复烤烟品种混杂的方法，本发明利用ISSR分子标记技术对几种复烤烟进行指纹图谱的构建，有利于区分出不同复烤烟，构建5个复烤烟品种的DNA指纹图谱数据库；为建立复烤烟纯度及真实性鉴定技术体系和技术规范奠定基础，为今后烟草业的研究及发展提供可靠的依据。

本发明提到的一种检测复烤烟品种混杂的方法，其技术方案是包括以下步骤：

（1）复烤烟DNA的提取：用DNeasy kit试剂盒提取DNA后在1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，并用分光光度计检测DNA提取纯度及浓度；

（2）引物合成：合成ISSR引物826和ISSR引物856，其中，ISSR引物826的引物序列：ACA CAC ACA CAC ACA CC；ISSR引物856的引物序列：ACA CAC ACA CAC ACA CYA，合成后，用ddH2O将引物溶解；

（3）简单重复序列间多态性-聚合酶链式反应，英文缩写为ISSR-PCR：

用ISSR引物826或者ISSR引物856在待检测的复烤烟中进行ISSR-PCR；

（4）比对标准图谱：

将待检测的复烤烟ISSR-PCR电泳后的成像照片与标准指纹图谱进行条带比对，如果条带能够吻合即为相应的品种之一，如果不能吻合即为混杂品种，检测完毕。

其中，步骤（1）复烤烟DNA的提取的具体步骤如下：

（a）取复烤烟样品用剪刀剪碎后放在研钵里，加入10 mL液氮研磨，期间再加一次10 mL液氮，继续研磨直至粉末状，用离心管取100 mg；