[发明专利]一种快速检测人Y染色体AZF区微缺失的方法、试剂盒及其制备

说明书

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种快速检测人Y染色体AZF区微缺失的方法、试剂盒及其制备。该试剂盒包括样本处理液、至少一种PCR反应液，每种PCR反应液包括针对内标基因和至少一个不同的STS位点的引物和探针。本发明提供的试剂盒能免提取基因组DNA，方便、快速、准确地检测人Y染色体AZF区微缺失。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种快速检测人Y染色体AZF区微缺失的方法、试剂盒及其制备。

背景技术

在男性不育患者中约有10％～15％是因为精子生成障碍所致的特发性无精子或少精子。引起特发性无精症(idiopathic azoospermia)、特发性严重少精症(idiopathicsevere oligozoospermia)、特发性少精症(idiopathic oligozoospermia)的原因极其复杂，遗传缺陷是其中的重要原因之一。1976年，Tiepolo等在细胞遗传学研究中发现无精症患者有Y染色体长臂的缺失，包括远端的荧光区和与之相连的非荧光区，因此推测Yq11存在着Y染色体精子生成基因或基因家族(azoosper-miafactor，AZF)的微缺失，称为“无精子因子”。目前资料报道，在无精子症和少精子症的患者中，有AZF缺失的约占3％～29％，发生率仅次于Klinefelter综合征(克氏综合征)，是居于第二位的遗传因素。

Y染色体上存在影响精子发生的无精子因子(AZF)区域，进一步可分为AZFa、AZFb、AZFc和AZFd四个区域。这些区域的缺失将导致精子发生障碍、少精、弱精、无精或畸精等症。

第一类现有技术方案是PCR-琼脂糖凝胶电泳法(如CN101575647B，一种Y染色体微缺失的基因检测方法；CN200710074317.X，男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒及检测方法；CN201210260960.2，一种Y染色体微缺失检测试剂盒；CN201510023696.4，一种Y染色体微缺失快速基因检测的扩增组合物、含有该扩增组合物的试剂盒及其应用)，此类方法有诸多不足之处，一是PCR结束后尚需开管电泳，不仅耗时长而且可能因污染导致假阴性结果；二是灵敏度较低易导致假阳性结果；三是操作繁琐不利于大规模样本检测。

第二类现有技术方案是PCR-琼脂糖凝胶电泳法的升级版，以测序仪(CN201210439356.6Y，染色体微缺失检测的扩增组合物及检测试剂盒)、毛细管电泳(CN201410425722.1，一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒)、DHPLC(CN201310537372.3，检测Y染色体微缺失的引物和试剂盒及其使用方法)等方法或仪器取代琼脂糖凝胶电泳，此几种方法虽然解决了琼脂糖凝胶电泳的灵敏度低、耗费人工等问题，但仍无法解决PCR后开管操作所带来的污染风险，另外测序仪、毛细管电泳系统或HPLC等仪器不仅价格昂贵，而且仪器操作和结果判读专业性要求较高，不易于推广。

第三类现有技术方案是荧光定量PCR法，其中染料法(CN101701248A，Y染色体微缺失SYBR Green I实时荧光定量PCR检测试剂盒)的不足之处在于染料不具序列特异性，导致引物二聚体也会产生荧光以及只能单重PCR无法加入内标进行内部质控，同时一个PCR反应仅能检测一个位点导致多位点检测的工作量巨大；采用探针法的几个技术方案(CN102703578BY，染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒；CN201210323595.5，检测Y染色体微缺失的实时荧光定量PCR试剂盒及方法；CN201410489611.7，一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒)的不足之处在于前期需另行提取基因组DNA，不仅增加了试剂成本及时间成本，而且提取过程中有因操作不当引起交叉污染或者样本混淆的风险。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种免提取基因组DNA、方便、快速、准确地检测人Y染色体AZF区微缺失的方法、试剂盒及其制备。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案。