[发明专利]一种城市污水处理厂/处理站微生物气溶胶的检测方法

权利要求书

1.一种城市污水处理厂/处理站微生物气溶胶的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)采样器及其配件准备，采样膜及其采样膜收集器具的准备及高温高压灭菌；

2)城市污水处理厂微生物气溶胶现场采样，运行空气采样泵，抽滤空气至无菌的玻璃纤维滤膜上，截留 空气微生物至采样膜上，记录采样过程中的气象参数；

3)采样膜的收集及存放，用无菌镊子将截留空气微生物的采样膜转移至无菌铝箔纸上密封，如不能立即 对样品进行后续处理，将其冻存-20℃或者-80℃的冰箱内待用；

4)DNA提取，提取玻璃纤维膜上的微生物DNA；

5)目的片段扩增，细菌16SrRNA和真菌18S基因PCR扩增；

6)高通量测序，利用高通量测序技术对细菌和真菌的目的序列进行测序；

7)序列分析，将下机的目的片段DNA序列对原始数据进行过滤处理，得到优化序列，去除嵌合体序列后 进行OTU聚类分析，对OTU的代表序列在Silva数据库中进行比对分析，鉴定微生物气溶胶中细菌 和真菌的分类；

8)群落结构及多样性分析，根据鉴定的细菌和真菌的分类信息，对微生物气溶胶的群落结构和多样性进 行分析。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中采样器采用中流量总悬浮微粒便携式采 样器，配以总悬浮颗粒物的颗粒物切割器，采样膜为亲水性的玻璃纤维膜，采样膜收集器具包括无菌 的镊子、铝箔纸、自封袋、直径为90mm的玻璃平板或者无菌一次性塑料培养皿。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中采样泵安装高度为人呼吸高度，即距地 面垂直高度1.5m处；对于污水处理厂的生物处理单元处，分别在水面处、距地面垂直高度1.5m处、 距地面垂直高度4m处设置三个采样点；采样流量为100L/min，玻璃纤维膜为直径90mm、对0.3μm 标准粒子的截留率>99.95％的圆形采样膜，采样时间设置为1h，2h，4h，8h，12h和24h，采样的同 时记录当时的气象条件。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤4)中玻璃纤维膜的颗粒物上附着的微生物的 总DNA提取包括以下仪器、器具和试剂：低温低速离心机、真空隔膜泵、玻璃过滤系统、与玻璃过 滤系统尺寸配套的水系滤膜、剪刀、镊子、50mL血清瓶、1×PBS缓冲液，，DNA提取试剂盒，除离 心机和抽滤泵外，其他均需在121℃灭菌15min。

5.如权利要求1或4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤4)中总DNA的提取方法如下：将冻存于 -20℃或者-80℃的冰箱内的玻璃纤维膜样品置于超净台中，用无菌的镊子夹取采样膜，用无菌剪刀 将其剪碎置于无菌的50mL血清瓶中，取适量无菌的1×PBS缓冲液冲洗剪碎的玻璃纤维膜并将其浸没， 封盖后上下颠倒血清瓶数次，冲洗采样膜的颗粒物至缓冲液中，将其置于低温低速离心机中，200g离 心2h，安装真空过滤系统，将上述离心后的缓冲液避开剪碎的滤膜倒入滤杯中，浓缩颗粒物至水系膜 上，用无菌镊子夹取该滤膜，按照DNA提取试剂盒的使用说明，对滤膜浓缩的颗粒物进行总DNA的 提取，由于空气中微生物的总DNA含量较低，在总DNA提取的最后一步，用50μL溶液收集总DNA， 以提高总DNA的最终浓度。

6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤5)中目的片段的扩增，细菌16SrRNA扩增采 用引物338F/806R，真菌18S基因扩增引物采用引物0817F/1196R。

7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤6)中高通量测序，采用IluuminaMiseq测序 平台，细菌采用PE250测序文库，真菌采用PE300测序文库。

8.如权利要求1-7任一所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括：微生物气溶胶的源解析及 逸散规律评估，比较不同污水处理工段微生物气溶胶样品之间的相似性，同时对城市污水处理厂微生 物气溶胶进行源解析，以综合评估微生物气溶胶的逸散特征。