[发明专利]一种基于基因测序法的HLA-B27基因分型的方法

权利要求书

1.用于HLA-B27基因型分型检测的引物及探针，其特征在于，HLA-B27荧光PCR及测序用引物的序列为：

HLA-B27F：5'-ACGTGGACGACACGCTGTTCG-3'

HLA-B27R：5'-GCAGCGTCTCCTTCCCGTTCT-3'

HLA-B27探针的序列为：

HLA-B27P：5'-GTTCGTGAGGTTCGACAGCGAC-3'

所述HLA-B27探针的荧光发光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ-1。

2.一种基于基因测序法的HLA-B27基因分型的试剂盒，其特征在于，包括内参体系反应液A、检测体系反应液B、酶解试剂、测序引物、测序试剂、阴性对照和阳性对照，

内参体系反应液A包括：PCR缓冲液、Mg²⁺、dNTPs、扩增内参基因的引物及探针，荧光PCR反应酶系；

检测体系反应液B包括：PCR缓冲液、Mg²⁺、dNTPs、引物及探针为权利要求1所述引物及探针，荧光PCR反应酶系；

测序引物为权利要求1所述引物。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，

内参体系反应液A包括：10×PCR缓冲液、MgCl₂2.0～5.0mM、dNTPs0.5～1.5mM、引物0.2～2.0μM、探针0.1～1.0μM、Taq酶2.0～4.0U、UNG酶0.5～1.0U，所述扩增内参基因的引物为β-ActinF:5'-CACCCAGCACAATGAAGA-3'，β-ActinR:5'-AAGGTGGACAGCGAGGC-3'，探针的序列为：β-ActinP:5'-CTCCTGAGCGCAAGTACTCCGTG-3'，所述探针的荧光发光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ-1。

4.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述酶解试剂为10×CIAP缓冲液、CIAP酶、ExoI酶和水，体积比为10:1:2:12。

5.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，测序试剂为测序Buffer和BigDye，体积比为1:1。

6.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，阴性对照为水；阳性对照为含有HLA-B27基因的人类基因组DNA溶液。

7.权利要求1所述引物及探针、或权利要求2-6任一项所述的试剂盒在进行HLA-B27等位基因检测和/分型中的应用。

8.一种利用权利要求2所述试剂盒进行HLA-B27基因型检测和/分型的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取基因组DNA作为模板；

(2)分别使用反应液A和反应液B进行荧光PCR扩增，对于反应液A有效扩增的模板进行下一步操作，A管有效扩增，B管无效扩增的样本视为阴性；反之视为阳性；

(3)将阳性样本反应液B扩增产物进行酶解，取酶解产物做测序反应，采用醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物，然后在PCR仪上进行热变性，冰上快速降温后，进行测序；

(4)将测序结果与NCBI数据库进行序列比对，确认被检测者HLA-B27阳性，然后根据HLA-B27各亚型的特异序列，得出其基因亚型甚至次亚型。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所检测和/分型的HLA-B27基因型为B27-01、B27-02、B27-03、B27-04、B27-05、B27-07、B27-10、B27-15。

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所检测和/分型的HLA-B27基因型为B27-01、B27-02-01、B27-02-02、B27-03、B27-04-01/04、B27-04-02、B27-04-03、B27-04-05、B27-05-03、B27-05-05、B27-05-06、B27-05-07、B27-05-08、B27-05-09、B27-05-10、B27-05-11、B27-05-12、B27-05-13、B27-05-14、B27-05-15、B27-05-16、B27-05-17、B27-05-18、B27-05-19、B27-05-20、B27-05-21、B27-05-22、B27-05-23、B27-05-24、B27-05-25、B27-05-26、B27-05-27、B27-05-28、B27-05-29、B27-05-30、B27-07-03、B27-07-04、B27-10、B27-15。