[发明专利]基于抗AFB1纳米抗体的亲和吸附材料

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于单域重链抗体(又称纳米抗体技术)的免疫亲和吸附材料，特别是针对黄曲霉毒素的免疫亲和吸附材料。

技术背景

黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉菌、寄生曲霉菌等真菌产生的剧毒次级代谢产物。它们的化学结构类似，为二呋喃香豆素衍生物，主要包括黄曲霉毒素B₁(AFB₁)、B₂(AFB₂)、G₁(AFG₁)、G₂(AFG₁)和M₁(AFM₁)等。在天然污染的食品和饲料中，AFB₁的污染最为常见，其毒性和致癌性也最强，被世界卫生组织的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物。世界各国及地区指定了严格的黄曲霉毒素限量标准，例如欧盟婴幼儿食品中AFB₁允许量≤0.10μg/kg。

现有的黄曲霉毒素检测方法主要有仪器分析法、免疫分析法以及薄层层析法。其中仪器分析法具有灵敏度高、准确性和重复性好等优点，但是对于分析样品前处理要求较高，需要尽量去除样品中的杂质以减少对后续检测的干扰。传统的前处理方法有液相萃取、固相萃取等，处理过程繁琐且特异性不高。亲和层析技术基于配基与待测物质之间特异性的识别，可通过一步操作实现对复杂混合样品中待测物的分离纯化。目前使用的黄曲霉毒素亲和纯化介质一般采用多克隆抗体或单克隆抗体作为配基，存在不耐有机试剂、活性迅速降低的问题。因此，需要开发活性高、稳定性好的新型配基替换传统抗体。单域重链抗体是由羊驼重链抗体的可变区组成，又称为纳米抗体，具有耐酸碱、耐高温以及易于生产等特性，相较于传统抗体具有明显的优势。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对黄曲霉毒素的免疫亲和吸附材料及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

针对黄曲霉毒素的免疫亲和吸附材料包括载体和配基，所述配基为单域重链抗体，具有SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列。该配基可特异性识别黄曲霉毒素。

所述配基还可以为在前述单域重链抗体基础上通过随机或定点突变技术进行改造所获得的能与黄曲霉毒素特异性结合的抗体。

所述载体为磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球或多孔材料。

上述黄曲霉毒素免疫亲和吸附材料的制备方法，其特征为：

所述载体为磁珠时，制备方法为：取1mg羧基磁珠于离心管中，加入500～1000μl活化缓冲液(10mM，NaH₂PO₄，pH6.0)，涡旋混合均匀，磁力架回收磁珠，再用活化缓冲液洗涤2遍。分别加入1～5mg碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，涡旋混合后，静置30min。用偶联缓冲液(10mM，Na₂HPO₄，pH7.4)洗涤磁珠3遍，加入抗黄曲霉毒素单域重链抗体，室温反应2～6h，得到共价偶联了抗黄曲霉毒素单域重链抗体的免疫磁珠；

所述载体为琼脂糖凝胶微球时，制备方法为：将CNBr活化的干胶用0.1MHCl洗涤10～15次，每次平衡5～10min。用偶联缓冲液(10mM，Na₂HPO₄，pH7.4)洗涤5～15次，加入抗黄曲霉毒素单域重链抗体，室温反应2～10h，得到共价偶联了抗黄曲霉毒素单域重链抗体的免疫亲和吸附材料；

所述载体为硅胶微球时，制备方法为：将硅胶微球用纯水和磷酸缓冲液(PBS，10mM，pH6.0)交替洗涤5～10次，用PBS缓冲液悬浮硅胶微球，加入抗黄曲霉毒素单域重链抗体，混匀，加入终浓度1～10mg/ml的碳二亚胺(EDC)，迅速混匀，4℃搅拌反应12～24h，得到共价偶联了抗黄曲霉毒素单域重链抗体的免疫亲和吸附材料。

将上述免疫亲和吸附材料(载体为琼脂糖凝胶微球和硅胶微球)装填至层析柱，即得到黄曲霉毒素免疫亲和层析柱，方法为：根据层析柱容量，取适量上述免疫亲和吸附材料于层析柱，加入5～10倍柱床体积的PBS(10mM，pH7.4)洗涤后，4℃，保存于20％乙醇溶液。

共价偶联了抗黄曲霉毒素单域重链抗体的免疫磁珠无需装柱，直接吸附后磁铁分离。

本发明还涉及装载有所述黄曲霉毒素免疫亲和吸附材料的亲和层析柱。