[发明专利]一种基于微流控芯片的人心脏模型的建立方法

权利要求书

1.一种用于建立人心脏模型的微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片主要由细胞入口池(1)、通道(2)、细胞培养室(3)和出口池(4)组成，细胞培养室(3)经直通道(2)连接细胞入口池(1)和出口池(4)，细胞培养室(3)为带有重复六边形凸起结构；

该微流控芯片由上下两层芯片材料不可逆封接而成，上层芯片材料为带有腔室和通道的可透光透气的PDMS聚合物，其上具有覆盖基底表面图案的腔室以及通道；

下层芯片材料为可透光透气的，表面带有重复六边形凸起结构的PDMS聚合物；

上层芯片材料经等离子体处理30-60s不可逆封接于下层材料上，上层芯片的细胞培养室覆盖基底带有结构的区域；

上层芯片材料的腔室及通道高度为200-2000um，可适用于流速为0.1ul/min-100ul/min的灌流培养；

下层芯片材料为六边形凸起的六边形长30-600um，宽10-100um，间距5-40um，高2-200um，重复个数20-2000。

2.一种基于权利要求1所述的微流控芯片的人心脏模型的建立方法，其特征在于按照以下步骤进行：

(1)hiPSC定向分化成心肌细胞

将人诱导多能干细胞接种到Matrigel包被的平板上培养至细胞密度增至孔板底面积的80％-90％，更换为RPMI 1640/B27-insulin培养基，并加入CHIR99021处理24小时，CHIR99021终浓度为12uM，然后换成RPMI1640/B27-insulin培养基培养，2天后加入IWP-2培养2天，IWP-2的终浓度为5uM，最后更换为RPMI 1640/B27培养基，每2-3天换一次培养基；

(2)芯片修饰

用移液器将配制好的Matrigel工作液经由细胞入口池加入芯片，将固定芯片的培养皿4℃静置过夜，12-36小时后37℃孵育30-90min，对通道底面进行修饰，促进人诱导多能干细胞来源的心肌细胞(HiPSC-CM)更好地贴壁；

(3)芯片内细胞的接种与培养

诱导的心肌细胞出现跳动后一周，用酶消化后，调整细胞密度为5×10⁶cells/mL，经由细胞入口池加入到芯片中，在Matrigel的修饰作用下，细胞迅速贴壁并均匀铺展于细胞培养室底面，当在光学显微镜下观察到细胞在细胞培养室中均匀分布时，立即将芯片移入二氧化碳培养箱中继续培养；

(4)人心脏模型的建立

待HiPSC-CM细胞经过沉淀完全铺满细胞培养室底面后，经由细胞入口池向通道中通入不含血清的细胞培养液并继续培养3-10天，使HiPSC-CM细胞处于流体剪切力的作用下。

3.按照权利要求2所述的微流控芯片的人心脏模型的建立方法，其特征在于步骤(2)中条件为：将固定芯片的培养皿4℃静置过夜，24小时后37℃孵育60min。

4.一种基于权利要求1所述的微流控芯片的人心脏模型的应用，其特征在于该模型用于观察芯片内细胞活性考察及功能变化的表征，具体包括以下几个方面：

(1)显微镜观察心肌细胞形态和跳动情况；

(2)常规免疫荧光染色法表征流体剪切作用后的HiPSC-CM细胞内cTnT的表达，用于表征心肌细胞成熟过程中结构和功能的变化，主要表征细胞内骨架的变化；

(3)RT-PCR检测细胞NK2.5、MYH6、MYH7、hCX43基因的相对表达水平，表征细胞功能在表达水平的变化。