[发明专利]一种发酵生产丁二酸的方法

说明书

本发明公开了一种发酵生产丁二酸的方法，其步骤包括产酸菌株构建和重组菌株发酵生产丁二酸。构建重组菌株的出发菌株为产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）NJ113（保藏号CGMCC No.1716）。利用该方法生产丁二酸，得到产酸菌株的方法简单方便，发酵方法简单可行，且产酸能力较强，可以大大降低生产成本，提高经济效益。重组菌株在合成培养基中无需外源添加谷氨酸的培养基中生长并高产丁二酸，在以葡萄糖为碳源时，在厌氧血清瓶中的发酵72h，消耗27g/L的葡萄糖产19.53g/L的丁二酸，丁二酸产率达到72.33%。

技术领域

本发明涉及一种发酵生产丁二酸的方法属于工业微生物及发酵技术领域。

背景技术

丁二酸，又名琥珀酸，是一种常见的天然有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。丁二酸作为TCA循环的中间产物以及厌氧代谢的终端还原产物之一，在生物代谢过程中占有非常重要的地位。近年来的研究结果表明丁二酸还可以作为C4平台化合物合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等大宗化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解聚酯。近年来，随着化石资源的日益枯竭和环境问题的日益严重，采用生物法制备丁二酸备受瞩目，美国能源部将丁二酸列为未来12种最有价值的生物炼制产品之一。

相对于化学合成法，生物合成制备丁二酸的方法受到越来越多的关注。生物合成丁二酸，是利用细菌，真菌等各种微生物，以葡萄糖或其他各种水解液为碳源，经微生物发酵生产丁二酸，相对于化学合成的方法，其一大优势是原材料为酸成为近年来研究的热点。

发酵菌株是丁二酸生物合成的关键点之一，多数细菌和真菌都能产生丁二酸，但是只有部分菌株可产生高浓度的丁二酸，丁二酸工业生产菌包括一些丙酸盐生产菌、典型的胃肠细菌以及瘤胃细菌。目前，丁二酸工业发酵菌株的研究主要集中在产丁二酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)，产丁二酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和大肠杆菌(Escherichiacoli)等。其中在丁二酸的发酵生产中，Actinobacillus succinogenes因其具有耐高底物、产物浓度，高产丁二酸，碳源广泛等优点已成为目前最具丁二酸产业化生产的潜在菌株之一。

McKinlay等利用合成培养基研究了Actinobacillus succinogenes发酵代谢过程，发现该菌株的必需氨基酸为谷氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸，并分析了该菌株的代谢网络，证明该菌株为谷氨酸缺陷型。而后通过检测其活体胞外的TCA相关酶活发现，Actinobacillus succinogenes缺乏TCA循环中的关键酶-柠檬酸合成酶和异柠檬酸脱氢酶，故其TCA循环不完全，无法积累谷氨酸合成的前体α-酮戊二酸，导致其不能自主合成谷氨酸(如图1)。奚永兰在论文(面向廉价生物资源利用的产琥珀酸放线杆菌合成丁二酸的机制解析与过程调控)中指出：Actinobacillus succinogenes NJ113在合成培养基不添加谷氨酸利用葡萄糖发酵产丁二酸，实验结果显示，初糖浓度为10g/L的，发酵12h后，约有8g/L的葡萄糖剩余。而对照，葡萄糖基本消耗完全。此结果也就说明Actinobacillussuccinogenes NJ113也为谷氨酸缺陷型菌株。因之前无合适的基因工具所以无法对产琥珀酸放线杆菌进行基因改造，故只能通过优化培养基配方来满足菌株的生长需求。

发明内容

本发明的技术的目的是针对现有产丁二酸菌株不易培养，产酸能力低的问题，提供一种发酵生产丁二酸的方法，利用该方法生产丁二酸，得到产酸菌株的方法简单方便，发酵方法简单可行，且产酸能力较强，可以大大降低生产成本，提高经济效益。

为达到本发明的目的，本发明采用的技术方案如下：