[发明专利]一种用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及海水养殖动物病原的分子检测方法，具体涉及一种利用环介导等温扩增技术(LAMP)研制的用于对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)病原的快速检测试剂盒及其应用。

背景技术

对虾养殖业是我国海水养殖的支柱产业，对虾生产和贸易已为我国农村经济发展、增加农民收入、创造就业机会做出了重要贡献，同时也为全球消费者提供更多优质蛋白食品做出了积极贡献。然而对虾养殖业的健康可持续发展一直面临着病害频发、种质退化和养殖环境恶化等诸多因素的挑战，其中对虾病害威胁最为严重，因为种质退化、抗病力下降和养殖环境恶化也间接导致了病害的频发。

自2009年在我国华南沿海南美白对虾养殖中突发一种被称为“偷死病”的疾病，该病一般在投苗20至30天后发生，病虾体色呈白浊并微红，昏睡、厌食、生长缓慢，疾病能扩散迅速，造成仔虾和幼虾阶段大量死亡，死亡对虾的肝胰腺呈现不同程度的缩小、褪色和坏死等病变特征(Lightneretal.,2012)，因此在学术上该疾病被称为对虾急性肝胰腺坏死病(Acutehepatopancreaticnecrosisdisease，AHPND)或早期致死综合症(Earlymortalsyndrome，EMS)。随后在越南(2010)、马来西亚(2011)和泰国(2012)等亚太地区相继报道了此疾病(Panakorn,2012；Flegel,2012；Mooney,2012)，目前已蔓延至拉丁美洲等多个对虾养殖国家和地区，无论是大型水产养殖公司，还是小型私人养殖户都遭受到了不同程度的经济损失，给全球的对虾养殖产业造成了新一轮的巨大冲击。

对虾AHPND的病原目前已被证实为一种特殊的副溶血弧菌，该弧菌携带一个约70kb的质粒pVA1，编码致死性毒素蛋白PirA和PirB，从而变成有毒菌株(Leeetal.,2015,PNAS)。为了降低对虾AHPND的爆发给对虾养殖业带来损失，建立可靠、快速的针对这株特异性副溶血性弧菌的检测方法至关重要。为此，泰国T.W.Flegel教授以及台湾罗竹芳教授为首的研究人员已经建立了基于普通PCR技术的检测方法。由于检测靶位点是针对70kb质粒pVA1的其它基因，而非PirA和PirB毒力蛋白，该PCR方法会造成假阳性检测结果；因为一些副溶血弧菌菌株携带pVA1质粒，但自然缺少PirA和PirB毒力蛋白。另外，PCR检测方法需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于对虾现场普及推广使用。

环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是由日本学者Notomi发明的一种新型核酸扩增技术，该技术针对靶基因的6或8个区域设计4或6条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在恒温条件下即可完成核酸扩增反应，扩增出LAMP特征性梯状条带。LAMP技术在保持PCR技术优点的基础上，进一步增强了反应的特异性和缩短了检测时间；特别是它不需使用昂贵的热循环仪，凝胶电泳和紫外检测等设备，降低了成本，已广泛应用于病原微生物的现场化检测。

本研究以对虾AHPND病原的毒力蛋白PirB为靶位点设计LAMP引物，以ESE-Quanttubescanner为恒温反应及检测平台，开发AHPND病原的LMAP试剂盒和检测方法。该检测方法能特异、快速检测pirB基因的存在，从而准确确定检测样品中是否存在AHPND病原。同时该方法使用ESE-Quanttubescanner仪器，通过吸收荧光来实时判断反应的进行，实现LAMP检测结果自动化和数据化，比传统LAMP终点判断产物的浊度或颜色变化更客观可靠；且该仪器便携、易操作，相比定量PCR仪，节约了大量成本；综述所述，本研究建立的方法能特异、快速检测AHPND病原，且适合养殖对虾现场使用。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒。

本发明的另一个目的在于公开了上述快速检测试剂盒在对虾急性肝胰腺坏死病病原检测中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒，其中，所述试剂盒由如下(a)或(b)组成：

(a)LAMP引物组、DNA聚合酶、LAMP反应液、阳性对照和阴性对照；或

(b)LAMP引物组、DNA聚合酶、LAMP反应液、阳性对照、阴性对照和显色剂SYTO-9。