[发明专利]一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白的制备方法在审
| 申请号： | 201510875293.2 | 申请日： | 2015-12-03 |
| 公开（公告）号： | CN105441453A | 公开（公告）日： | 2016-03-30 |
| 发明（设计）人： | 金成浩;罗英花;孙虎男;韩英浩;臧延青;刘畅 | 申请（专利权）人： | 黑龙江八一农垦大学 |
| 主分类号： | C12N15/12 | 分类号： | C12N15/12;C12N15/70;C07K14/705;C07K1/22;C07K1/16;C07K1/113;A61K38/17;A61K47/48;A61P35/00;A61P19/02;A61P29/00 |
| 代理公司： | 北京国智京通知识产权代理有限公司 11501 | 代理人： | 孙文彬 |
| 地址： | 163319 黑*** | 国省代码： | 黑龙江;23 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 聚乙二醇 修饰 trail 重组 蛋白 制备 方法 | ||
1.一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述诱导配体为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL，所述制备方法为化学修饰方法，包括以下步骤：
步骤一：HZ-TRAIL的制备：利用PET表达载体对人类TRAIL蛋白中114-281基因序列进行基因克隆，制备出具有N-末端组氨酸标签和异亮氨酸拉链基序重组基因PET23dw-His-ILZ-hTRAIL114-281的TRAIL重组蛋白，简称HZ-TRAIL；
步骤二：HZ-TRAIL的提取和纯化：将步骤一制备出的HZ-TRAIL转化到大肠杆菌中，并在含有1mmol/L异丙基硫代半乳糖苷的LB培养液中进行扩繁处理，然后将HZ-TRAIL在大肠杆菌中重组表达，大肠杆菌细胞通过声波降解法裂解，并离心处理后，取20ml上清液缓慢注入到镍-氮三乙酸螯合琼脂糖柱中，使HZ-TRAIL中的组氨酸和金属镍离子充分吸附，利用镍-亲和色谱法进行逐步洗脱提取HZ-TRAIL，再经凝胶过滤层析法进行纯化，保存在-20℃，备用；
步骤三：PEG-HZ-TRAIL的制备：取重量份数为1份的步骤二制备出的HZ-TRAIL加入到pH为5.0重量份数为0.15份的醋酸盐缓冲液中，加入聚乙二醇修饰剂和还原剂，在低温4℃状态下进行N端氨基修饰，使PEG以共价键偶联到HZ-TRAIL蛋白的N端氨基上，即为PEG-HZ-TRAIL蛋白，反应时间为8-12小时，得到生成PEG-HZ-TRAIL蛋白的反应混合物；
步骤四：PEG-HZ-TRAIL的纯化：将所述步骤三制备出的反应混合物利用凝胶过滤层析法进行分离纯化，然后通过超滤法浓缩，最终得到PEG-HZ-TRAIL。
2.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤二中的扩繁处理条件为在25～30℃，扩繁6～9个小时。
3.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤二中的离心处理条件为调节转速为12000rpm，温度为4℃，离心处理20min。
4.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤三中的还原剂为NaCNBH3，所述加入还原剂的重量份数为0.13份。
5.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤三中加入聚乙二醇修饰剂的重量份数为2～10份。
6.根据权利要求5所述的一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤三中加入聚乙二醇修饰剂的重量份数为7.5份。
7.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤三反应时间为8h。
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