[发明专利]一套用于细菌耐药基因NDM-1检测的多核苷酸、方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于细菌耐药基因——新德里金属β‑内酰胺酶‑1基因(NDM‑1)检测的多核苷酸、方法和试剂盒。具体地本发明中公开了可用作细菌耐药基因NDM‑1实时荧光PCR检测标准分子的多核苷酸和DNA构建物pXL08。本发明的质粒标准分子解决了细菌耐药基因NDM‑1实时荧光PCR检测中标准物质缺乏的难题，保证细菌耐药基因NDM‑1实时荧光PCR方法检测结果的可比性，为细菌耐药基因NDM‑1实时荧光PCR方法检测提供了可靠质量控制方法。

技术领域

本发明涉及一套生物工程技术领域的质粒分子，具体涉及一套用于细菌耐药基因——新德里金属β-内酰胺酶-1基因(NDM-1)检测的多核苷酸、方法和试剂盒。

背景技术

近年来，随着抗生素的广泛应用，多种细菌出现不同程度的耐药性。2010年9月，印度、英国、瑞典、巴基斯坦和澳大利亚学者联合报道了一种几乎能抵抗所有抗生素的细菌，称为“超级细菌”，该细菌能产生一种新的金属β-内酰胺酶，其水解活性远高于现有的金属β-内酰胺酶。由于首个感染病例在印度新德里发现，因此，该酶被称为新德里金属β-内酰胺酶-1(New Delhi metallo-blactamase-1，NDM-1)。NDM-1具有强大的水解作用，几乎能抵抗目前使用的所有抗生素，已严重威胁人类健康。NDM-1的基因长度为813bp，编码NDM-1酶的基因位于1个长度为140000bp的质粒上。质粒是游离于细菌DNA基因组之外、可移动的遗传原件，能够在不同种属细菌间发生转移，从而导致耐药性在细菌中的扩散。携带NDM-1质粒的细菌主要是医院感染相关的细菌。另外，NDM-1感染患者通过环境传播、医护人员的接触传播均能造成耐药菌的扩散感染，使院内感染面临前所未有的挑战。

质粒DNA标准物质是一种含有检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，在PCR定性检测中可以作为阳性对照，在PCR定量分析中可以作为定量分析的标准品，构建定量分析的标准曲线。但是由于受到DNA定量检测量值溯源水平的限制，目前可查的质粒DNA标准物质还比较少，针对NDM-1耐药基因PCR检测的质粒DNA标准物质还是空白。在生物计量科学领域，质粒DNA标准物质研究受到广泛重视，参与该领域研究的国际国内单位包括美国的国家标准技术研究院(NIST)，英国政府检测标准集团(LGC)，欧盟委员会联合研究中心标准物质与测量研究院(IRMM)以及中国计量科学技术研究院等，至今已经有5个质粒有证标准物质研发成功。由于针对NDM-1耐药基因PCR相关检测方法的质粒DNA标准物质的研制还是空白，在实际NDM-1耐药基因PCR检测 时，各单位使用的多是自行设计构建的质粒DNA分子作为标准品，其中的目的基因特异性片段各不相同，同时缺乏统一的定值方法，质粒DNA分子定值准确度差，造成各实验室之间的检测结果差异极大，缺乏可比性、有效性和可靠性。

发明内容

本发明的目的在于提供一套适用于细菌耐药基因NDM-1实时荧光定量PCR检测的质粒标准分子及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含细菌耐药基因NDM-1的序列。

在另一优选例中，所述细菌耐药基因NDM-1的序列选自下组：

(a)序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸序列；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸序列；

(c)序列与SEQ ID NO.:1所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为SEQ IDNO.:1所示序列长度的20％-100％(较佳地50％-100％，更佳地80％-100％，最佳地90％-100％，如95％)的多核苷酸序列；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

在另一优选例中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。