[发明专利]一种发酵生产混合醇的方法有效
申请号: | 201510875864.2 | 申请日: | 2015-12-02 |
公开(公告)号: | CN105586365B | 公开(公告)日: | 2019-11-26 |
发明(设计)人: | 董维亮;姜岷;赵洁;孔祥平;王超;贺爱永;马江锋;吴昊 | 申请(专利权)人: | 南京工业大学 |
主分类号: | C12P7/16 | 分类号: | C12P7/16;C12P7/02;C12N15/75;C12R1/145 |
代理公司: | 32230 江苏致邦律师事务所 | 代理人: | 徐蓓<国际申请>=<国际公布>=<进入国 |
地址: | 211816 江苏省南京市浦口区浦*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 发酵 生产 混合 方法 | ||
1.一种发酵生产混合醇的方法,其特征在于:所述方法分两步进行,具体如下:
第一步构建重组菌株:选用保藏号为CCTCC NO:M2010011的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)XY16为出发菌株,将表达载体pIMP1-ptb-sadh导入到出发菌株中,获得表达sadh基因的重组菌株;所述表达载体pIMP1-ptb-sadh的构建方法具体如下:用NdeⅠ单酶切载体pIMP1-ptb,酶切线性化产物经纯化试剂盒纯化后,sadh通过一步克隆连接;将一步克隆连接的重组质粒转化到大肠杆菌(E.coli)DH5a,涂布到含有100ug/ml氨苄霉素抗性LB平板,37℃培养12-16h,挑取转化子,接到液体含有100ug/ml氨苄霉素LB培养基中,37℃、200rpm培养12h,提取重组质粒,经测序验证获得能够利用ptb启动子表达sadh的载体pIMP1-ptb-sadh;
所述表达载体pIMP1-ptb-sadh采用电转化方式导入到出发菌株中;所用电转化缓冲液配制采用270mM蔗糖,5mM NaH2PO4,缓冲液pH=7.4;电转化条件为2.0kV,电阻200Ω,电容25uF;
第二步生产混合醇:将重组菌株接入种子培养基中,通入氮气培养,在发酵培养基中加入氯化钙或碳酸钙进行厌氧发酵;
所述重组菌株厌氧发酵的发酵温度为37℃;发酵时间为72h;所述氯化钙浓度为2g/L;所述碳酸钙浓度为10g/L。
2.根据权利要求1所述发酵生产混合醇的方法,其特征在于:所述种子培养基配制如下:酵母粉0.3%,蛋白胨0.5%,可溶性淀粉1%,乙酸铵0.2%,氯化钠0.2%,七水合硫酸镁0.3%,磷酸二氢钾0.1%,磷酸氢二钾0.1%,七水合硫酸亚铁0.01%。
3.根据权利要求1所述发酵生产混合醇的方法,其特征在于:所述重组菌株厌氧发酵过程中,每1L发酵液采用的发酵培养基按照如下方法制备:葡萄糖6%,乙酸铵0.22%,磷酸二氢钾0.05%,磷酸氢二钾0.05%,氯化钠0.001%,七水合硫酸镁0.02%,七水合硫酸亚铁0.001%,一水合硫酸锰0.001%,玉米浆0.1%,碳酸钙1%(或氯化钙0.2%),红霉素10ug/mL。
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