[发明专利]重组乙酰胆碱酯酶在甲醇毕赤酵母中表达的中试发酵方法

说明书

本发明公开了一种重组乙酰胆碱酯酶在甲醇毕赤酵母中表达的中试发酵工艺：首先将活化的重组毕赤酵母菌株进行培养，制得发酵工作种子液，然后将该其转接到基础盐培养基中，氨水或磷酸调整发酵体系pH后接种，并加入适量微量元素溶液，生长至一定阶段后，加入甘油与微量元素的混合溶液，最后流加含微量元素的甲醇溶液进行蛋白诱导发酵，发酵过程中温度持续维持在29℃，DO维持在20%以上，甲醇诱导120h，整个发酵过程结束。本发明的发酵工艺简单，操作方便，蛋白可溶性表达且表达量高，酶活性高，但蛋白表达成本却较低。本发明首次在酵母表达系统内对乙酰胆碱酯酶进行了大规模的发酵罐表达，为AChE的大规模生产和最终应用奠定了基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种重组乙酰胆碱酯酶在甲醇毕赤酵母中表达的中试发酵方法。

背景技术

农药在农林作物病虫草害防治过程中得以广泛使用,对农业增产有着非常重要的作用,但在一定时期内农作物上会有部分农药残留,如果长时间摄食残留农药的农作物，会对人体健康造成影响。农药是通过抑制昆虫中枢神经中的胆碱酯酶使之死亡而发挥杀虫作用的,同时对人体内的胆碱酯酶也有抑制作用,能阻断神经递质的传递,达到一定量后会引起肌肉麻痹,造成中毒、致癌、致畸、致突变等危害。近年来,随着农药残留研究的不断深入,农药残留的检测方法也日趋完善,并向简单、快速、灵敏、多残留检测、低成本、易推广的方向发展。用于残留农药检测的酶有羧酸酯酶、丁酰胆碱酯酶及乙酰胆碱酯酶,前两种酶检测时受干扰因素多,假阳性率高,专一性低。乙酰胆碱酯酶(Acetycholinesterase,AChE)是存在于中枢神经系统内的一种水解酶，经典作用是水解神经递质乙酰胆碱(ACh)，终止神经冲动的传导。由于常见的残留农药主要是有机磷和氨基甲酸酯类药剂，通过抑制昆虫中枢神经中的胆碱酯酶而使之死亡。因此，AChE作为此类农药的最适反应底物，在农药残留的快速检测中得到了广泛应用，尤其是基于AChE的生物传感器已成为农残检测研究中的热点。

由于AChE主要是从昆虫或动物血液中提取，产量低，成本高、灵敏度变化幅度大，严重阻碍了AChE在农药残留检测中的应用。随着基因工程技术的发展，可以通过克隆AChE基因，使其在外源表达系统中高效表达。研究发现，AChE不适于原核表达，表达后无生物学活性，但利用真核表达系统（如酵母、昆虫等）则可以保持其完好的生物学活性。

毕赤酵母(PichiaPastoris)为单细胞真核生物,生长快、易于分子遗传学操作；毕赤酵母的醇氧化酶(AOXI)基因的启动子具有强诱导性和强启动性,适于外源基因的高水平诱导表达；毕赤酵母具有强烈的好氧生长偏爱性,可进行细胞高密度培养,利于大规模工业化生产；毕赤酵母可高水平分泌表达外源蛋自,并且由于毕赤酵母自身分泌到培养基中的蛋白很少,更有利于后期纯化；同时外源基因不是存在于自主复制的质粒中,而是和表达载体一起整合到了酵母染色体上,随染色体一起复制和遗传,不会发生外源基因的丢失现象。由于该表达系统的诸多优点,人们越来越多地利用它作为外源基因的表达系统来生产目的蛋白。但时至今日，在酵母表达系统中对乙酰胆碱酯酶进行大规模发酵表达却未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组乙酰胆碱酯酶在甲醇毕赤酵母中表达的中试发酵方法，该方法操作简单，蛋白表达成本低且表达量高、酶活性高。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的重组乙酰胆碱酯酶在甲醇毕赤酵母中表达的中试发酵方法为：

首先将活化保存的重组毕赤酵母菌株进行培养，制得发酵工作种子液，然后将该发酵工作种子液按一定的接种量转接到基础盐培养基中，调整发酵罐温度29℃，罐压0.06MPa，转速600rpm,利用氨水或磷酸调整发酵体系pH为5.2,校正溶氧DO达到100%后开始进行发酵：