[发明专利]一种等离子体处理与转基因结合的玉米育种方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种等离子体处理与转基因结合的玉米育种方法，属于农业育种技术领域。

背景技术

玉米(ZeamaysL.)是世界上重要的粮食、饲料作物，也是现代工业的重要原料。随着工农业的发展及世界人口的增长，对玉米的需求量逐年攀升。据相关研究推测，到2020年世界玉米需求量将达到7.53亿吨,届时中国玉米需求量为2.14亿吨，将使玉米生产面临巨大挑战。

但传统的育种方法面临着推广品种单一化，育种材料遗传基础越来越狭窄，基因库日益贫乏等问题，加之常规育种周期长，预见性差，很难使作物在产量、质量和抗性方面有大的提高。

传统玉米育种在过去的几十年确实有很大的成就，但由于育种时间过长、效率较低、品种单一化、育种材料遗传基础越来越狭窄、预见性差等局限性，导致低水平重复、同质化严重，很难使作物在产量、质量和抗性方面有大的提高。目前传统玉米育种遇到很大瓶颈，甚至停滞。

利用太空特殊的环境条件对植物种子产生的诱变来进行良种选育成为一种新兴的育种方法，然而太空育种是人工诱变育种的一种新方法，所有人工诱变的发生均是随机的，目前还做不到定向诱变，太空育种的成功率随着物种的不同也会有很大差别，并且太空育种的成本相当高，不是一般单位和个人能够承担的。

近年来，随着生物技术的迅速发展和不断完善，采用基因工程手段进行作物遗传育种和新种质的创造已成为可能，运用转基因技术提高作物产量的报道屡见不鲜。Dinkins等(2003)利用基因枪技术将15kDaδ-玉米醇溶蛋白基因转入大豆中，对转基因后代进行氨基酸组分分析，发现甲硫氨酸提高了12％～20％，半胱氨酸提高了15％～35％，而其他的氨基酸组分没有发生明显的变化。丁明忠等(2000)利用花粉管通道法和减压渗透法将大豆总DNA导入玉米，筛选到8个高蛋白材料，玉米种子中蛋白质含量比对照提高20％。Zheng等(1995)将菜豆种子蛋白质基因导入水稻中表达，使得转基因水稻种子总蛋白含量增加4％，赖氨酸含量也有所提高。Regierer等(2002)把修饰过的质体腺苷酸激酶基因导入马铃薯中，转基因马铃薯块茎中腺苷酸水平得到明显提高，淀粉含量增加了60％，块茎产量增加了39％。这些研究成果，为高产育种技术奠定了基础，也表明了随着转基因技术的兴起，优质、高产的良种选育技术将步入一条快速、崭新的道路。

农杆菌介导法具有能够转移相对较大DNA片段、更有效地产生单位点整合、不易引起分子间或分子内重排、转化效率高等优点，一直备受科研工作者的青睐。但是由于单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，因此人们一直认为农杆菌介导的转化方法只适合于双子叶植物和大多裸子植物的转基因操作，以至于此方法在玉米的遗传转化上没有得到过应用。直到上世纪八十年代，经过国内外研究者的不懈努力，农杆菌介导法在玉米遗传转化上的应用才取得了一些重要进展。

目前并未见到将等离子体处理技术与转基因相结合的玉米育种方法的报道。

发明内容

针对上述现有技术，一种等离子体处理与转基因结合的玉米育种方法

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种等离子体处理与转基因结合的玉米育种方法，步骤如下：

(1)将玉米品种的种子进行冷等离子体处理：将玉米品种的父母本种子置于冷等离子体处理机内，在140W的处理功率下对玉米种子进行18秒的非电离幅射处理，处理以氦气为工作介质，在真空封闭环境中进行；

所述玉米品种选自鲁种99118号、DH4866、齐319等；

(2)上述处理后的玉米种子，用70％乙醇(体积浓度)浸泡30～45s，用无菌水洗1～2次，而后用0.1％的HgCl₂溶液(质量浓度)浸泡8～10min，再用无菌水冲洗4～5次，用滤纸吸干表面残留液体后，接种于不含抗生素的MS发芽培养基上，26±1℃暗培养1～2天，待种子萌动(露白)后，将其放在改良MS培养基上于黑暗条件下萌发；待胚芽伸长止3～4厘米时，剥离胚芽鞘及2～3片幼叶，露出茎尖顶端生长锥；

(3)利用基因重组技术，将目的基因导入空白基础载体构建重组载体；所得重组载体经三亲杂交法将目的基因转移至农杆菌，挑取单菌落，进行PCR鉴定得到目标农杆菌；

所述目的基因可以是ZmPIN1a基因、ZmPIN1b基因或精氨酸酶基因ZmArg；