[发明专利]用于检测鱼类小清蛋白的荧光定量PCR方法及引物对

说明书

本发明涉及一种用于检测鱼类小清蛋白的荧光定量PCR方法及引物对，属于食品安全检测技术领域，所述PCR方法包括以下步骤：一、设计特异性扩增引物对；二、提取样品DNA；三、通过扩增曲线和溶解曲线判断样品是否含有小清蛋白基因；本发明还涉及一种引物对，该引物对具体为：鱼类小清蛋白引物的碱基序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。与现有技术相比，本发明利用生物信息学和比较基因组学，筛选到鱼小清蛋白的共有基因序列，并以此序列设计特异性扩增引物对，本发明的引物对待测样本进行荧光定量PCR检测，可快速、灵敏、特异地检测食品中不同鱼种及制品中的过敏原成份—小清蛋白。

技术领域

本发明涉及食品安全检测技术领域，具体涉及一种用于检测鱼类小清蛋白的荧光定量PCR方法及引物对。

背景技术

1969年，Aas和Elsayed首次鉴定出了太平洋鳕鱼(Gadus callarias)的主要过敏原并将其命名为Gad c 1，是世界上第一批被鉴定的食物过敏原之一。Gad c 1由113个氨基酸和1个葡萄糖分子构成，分子量约为12kD，属于小清蛋白，是一种钙结合蛋白，这种小清蛋白大量存在于低等脊椎动物的白色肌肉中。小清蛋白按照氨基酸序列的不同可分为两个不同的类型：α型小清蛋白pI≥5.0，含少量酸性小清蛋白，β型小清蛋白pI≤4.5，酸性小清蛋白含量较高。鱼类中小清蛋白大部分属于β型。

鱼类小清蛋白之间具有很高的氨基酸序列同源性(60～90％)，接近70％的患者对不同鱼类的小清蛋白存在交叉反应。目前的鱼类小清蛋白的检测方法主要有血清学检验和蛋白质特性方法，其中，血清学方法(RAST,CAP等)都依赖于过敏患者的血清，而血清个体差异较大，此外，商业化的过敏原固相载体与IgE的结合能力也不尽相同，所以在食品过敏原检测的商业推广上有较大的难度；而基于蛋白特性的ELISA分析是在质量稳定的动物抗体基础上，特异性和灵敏性都不错，尤其对于深加工产品中热稳定蛋白的稳定性要高于DNA，但是要获得一高特异性的抗体比较困难。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种以目前应用最成熟、操作最简便的PCR法(检测特异基因序列)为基础，建立多种鱼类及产品中致敏原的荧光定量PCR检测方法及引物对，提出了一种检测时间短、成本低、检测结果特异性好的用于检测鱼类小清蛋白的荧光定量PCR方法和引物对；不仅有利于适应食品加工领域实现脱敏、低敏食品生产的在线检测，从源头上降低过敏发生的可能性，还对农业、卫生及其他质量管理部门规范食品成分标识，保障食品安全具有重要作用。

发明内容

本发明目的在于克服现有基于蛋白的检测方法在某些食品检测中的局限性，提供一种检测时间短、成本低、检测结果特异性好的用于检测鱼类小清蛋白的荧光定量PCR方法和引物对。

本发明是通过以下技术方案实现的：

检测鱼类小清蛋白的荧光定量PCR方法，具体包括以下步骤：

步骤一、根据编码鱼类小清蛋白基因序列的保守片段设计特异性扩增引物对；

步骤二、提取样品DNA，利用步骤一所得特异性扩增引物对采用SYBR荧

光定量PCR方法进行扩增；

步骤三、通过扩增曲线和溶解曲线判断样品是否含有小清蛋白基因。

较佳地，在步骤一中，所述引物对具体为序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

较佳地，在步骤二所述的荧光定量PCR方法中，PCR反应体系具体为：2×的SYBRPremix Ex Taq 10μl，0.4μl的引物混合液，其上下游引物的浓度均为10μM，ROX ReferenceDye II 0.4μl以及6.8μl的去离子水，DNA模板2μl；其中，所述2×SYBR Premix Ex Taq反应液为Takara公司产品，目录号：RR420。