[发明专利]一种濒危羊踯躅多态性SSR分子标记开发与应用的方法

权利要求书

1.一种濒危羊踯躅多态性SSR分子标记开发与应用的方法，其特征在于，

（1）濒危羊踯躅SSR分子标记的获得：利用简化基因组测序技术对濒危羊踯躅基因组进行测序，经序列数据过滤、聚类和组装步骤，得到171.534 Mb的基因组序列，包含498,252contigs，测序质量合格，GC分布正常，采用SSR搜索软件对contig序列进行SSR检测搜索，最后从11,961微卫星位点中开发得到11,687 SSR分子标记；

（2）SSR分子标记的筛选与合成：从11,687 SSR分子标记中选取94对SSR进行遗传多样性的筛选鉴定，SSR分子标记初选的条件是2个碱基重复单元的SSR需要有10~15个拷贝的重复，3个碱基重复单元的SSR需要有6~12个拷贝的重复，开发设计好的SSR分子标记引物序列合成；

（3）濒危羊踯躅多态性SSR的鉴定：采用不同地理分布的羊踯躅DNA对合成94对SSR引物进行PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，最后从94对SSR引物中获得16对的多态性SSR分子标记，见表1；

（4）濒危羊踯躅多态性SSR分子标记的有效性评估：将筛选获得16对多态性SSR标记在2个羊踯躅自然居群，每个居群含21个个体，进行PCR扩增，评估分析了这16对多态性SSR标记能够用于羊踯躅的遗传多样性分析和保护生物学研究，见表1；

（5）多态性SSR分子标记应用：运用本研究获得的多态性SSR分子标记在8个濒危羊踯躅自然居群，含193个个体，进行了遗传多样性分析，获得了一些保护濒危羊踯躅的科学依据，即濒危羊踯躅Shannon多样性指数I为1.768，基因多样性指数H为0.777，江西省金溪县居群的遗传变异最丰富，而福建政和的遗传多样性水平最低，见表2，PCA分析和UPGMA分析都表明8个自然群体被分为两组，江西永修居群独立为一组，羊踯躅以就地保护为主，应优先保护金溪、永修居群，同时增加对政和和京山居群的保护权重；

表1 濒危羊踯躅16对多态性引物序列特征及其在个自然居群中的遗传特性

* 表示显著偏离哈德温伯定律; F: 正向引物; R: 反向引物; A: 等位基因数; H_o:观测杂合度; H_e: 期望杂合度；

表2 濒危羊踯躅8个自然居群的遗传多样性

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