[发明专利]一种鸡干扰素冻干剂的制备方法

权利要求书

1.一种鸡干扰素冻干剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，

步骤一：无菌采集健康鸡鲜血，于10℃的条件下离心20min，吸取中间层白细胞，用质量 分数为0.85％NH₄Cl洗涤两次后离心，收集沉淀白细胞，除去NH₄Cl，按照白细胞：培养液体 积比1:15加入含5％鸡血清的Eagle`sMEM混合培养液悬浮，将鸡白细胞数稀释在10×10⁷个/ml～25×10⁷个/ml之间，制得鸡白细胞悬浮液；

步骤二：取一份鸡白细胞悬浮液，加入含100个活性单位的鸡白细胞干扰素，置于37℃ 水浴摇床搅拌培养36h；

步骤三：按照每毫升鸡白细胞悬液50HANDVⅡ的加入量，在细胞悬液中加入一定量新 城疫病毒NDVⅡ，调节pH为7.2，在水浴恒温振荡器37℃旋转培养24h，培养完成后，用6MHCl 把培养液的pH调至3.5，在4℃下酸化处理4d，再用质量体积浓度6%的NaOH溶液把pH调至 7.2，离心去除沉淀，取上清液，制得鸡白细胞干扰素粗制液；

步骤四：取一份鸡白细胞干扰素粗制液，用NaOH溶液调节pH值到8.5，在冰浴条件下，按 照干扰素粗制液：聚乙二醇酯摩尔比1:5向溶液中加入聚乙二醇酯，聚乙二醇酯加入量为五 份，升温至4℃，搅拌反应2h，向溶液中加入五份聚乙二醇酯，升温至12℃，搅拌反应2h，向溶 液中加入五份聚乙二醇酯，升温至25℃，搅拌反应2h，向溶液加入五份聚乙二醇酯，升温至 36℃，搅拌反应2h，完全反应后，加入0.75Μ的半胱甘氨酸终止反应，得到聚乙二醇酯修饰 的干扰素；

步骤五：取一份聚乙二醇酯修饰的干扰素，取适量去离子水作为溶剂，按照聚乙二醇酯 修饰的干扰素：烷基丁二酸酯磺酸钠摩尔比1:1向溶液中加入烷基丁二酸酯磺酸钠，用盐酸 调节pH为2.6，按照烷基丁二酸酯磺酸钠：α-氰基丙烯酸丁酯摩尔比1:2.5向溶液中加入α- 氰基丙烯酸丁酯，搅拌10min，再用NaOH调节溶液的pH为5.8，继续搅拌反应，用0.8μm微孔滤 膜除去大的纳米球，得纳米球乳状胶体溶液；

步骤六：取一份纳米球乳状胶体溶液，完全浸泡在0.85%~0.9%的盐水中，维持温度在 3.2~3.9℃的条件下，按照纳米球乳状胶体：渗透性保护液体积比1:1.5在次声波振荡条件 下加入渗透性保护液，继续在次声波条件下振荡30~45s，将溶液置于真空度0.98的环境下， 设置温度为-12℃，冷冻24h后将溶液置于真空度0.98的环境下，投入液氮中，冷冻3h后，将 溶液取出置于真空度0.98的环境下，设置温度为-20℃，按照120Pa/min的速度恢复气压至 常压，得到鸡干扰素冻干剂。

2.如权利要求1所述的一种鸡干扰素冻干剂的制备方法，其特征在于：所述渗透性保护 液由3%~3.8%的DMSO，4.8%~5.6%的明胶，0.6%~1.0%的单糖，2.8%~3.2%的半胱甘氨酸，1.8%~ 2.4%的人血清白蛋白，1.4%~2.0%的吐温-800，0.5%~0.7%的NaCl，4.9%~5.1%的甘露，20%~ 34%的乙酸乙酯和44.2%~58.2%的去离子水组成。

3.如权利要求1或2所述的一种鸡干扰素冻干剂的制备方法，其特征在于：所述渗透性 保护液由3.4%的DMSO，5.2%的明胶，0.8%的单糖，3%的半胱甘氨酸，2.1%的人血清白蛋白， 1.7%的吐温-800，0.6%的NaCl，5%的甘露，27%的乙酸乙酯和51.2%的去离子水组成。

4.如权利要求3所述的一种鸡干扰素冻干剂的制备方法，其特征在于：所述单糖包括 0.3%~0.5%的葡萄糖和0.5%~0.7%的果糖。

5.如权利要求1或4所述的一种鸡干扰素冻干剂的制备方法，其特征在于：所述次声波 的频率为8~13Hz。

6.如权利要求5所述的一种鸡干扰素冻干剂的制备方法，其特征在于：所述聚乙二醇酯 的分子量为为42KDa。

7.如权利要求6所述的一种鸡干扰素冻干剂的制备方法，其特征在于：所述DMSO的浓度 为0.34~0.37g/mL。