[发明专利]一种小鼠胰岛分离纯化方法

说明书

本发明公开了一种小鼠胰岛分离纯化方法，采用自制的穿刺针由胆总管逆行穿刺并灌注胶原酶Ⅴ消化胰腺，使用一种密度梯度介质离心结合手工挑选的方法分离纯化胰岛。双硫腙染色鉴定胰岛纯度，AO/PI染色鉴定胰岛活力。葡萄糖刺激的胰岛素释放实验检测胰岛功能。采用此法在大规模的提取胰岛时可以很大程度的节省时间，提高穿刺成功率，减少Ficoll400配制的时间及价格。同时，纯化所得胰岛产量、纯度、活力及胰岛功能都相对良好，是一种简单快捷，廉价高效的小鼠胰岛分离方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种小鼠胰岛的分离纯化方法。

背景技术

随着经济的发展，人民的物质水平的提高，糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)的患病率也日益增长。截止到2010年，中国成人DM的患病率已达到11.6％。然而目前针对糖尿病尚缺乏完全治愈的方法，对DM的研究也是世界上很多科学家的共同面对的挑战。针对2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)的基础研究或者1型糖尿病(Type 1 DiabetesMellitus,T1DM)的胰岛移植很大程度上依赖于动物胰岛的研究，故而成功的胰岛分离、纯化则成为上述研究的前提。

早在1911年就有学者从豚鼠胰腺中提取出胰岛，随后不断有学者对该法进行改进，依次出现了酶消化法、胆总管灌注法、Ficoll400密度梯度离心法等分离及纯化的方法。然而，局限于各个实验室的操作体系、小鼠的品系、分离及纯化方法的不同，各个实验室胰岛的得率、纯度、活力及胰岛功能也不一致。

获得数量足够和功能良好的胰岛是2型糖尿病基础研究及1型糖尿病胰岛移植获得成功的关键。现已证实，胰岛占整个胰腺体积的1％-2％，一只小鼠平均约有2000个胰岛，规范的胰岛提取步骤可以提取约200个胰岛。

而小鼠胰岛的产量及功能与诸多方面密切相关。首先与小鼠的品系、体重及胰腺体积等因素有关。Bock等人比较了7种品系不同体重小鼠的胰岛含量，发现小鼠的品系对胰岛数量的差异性贡献最大。此外，张梅等人发现高体重的小鼠(正常小鼠)胰岛数量显著高于低体重小鼠。

其次，小鼠胰岛的产量及功能还与分离方法有关。早在1911年，Bensley等人就从豚鼠中采用手工挑选法获得了胰岛并对其染色，然而其获得的胰岛无论从数量还是功能上来讲都不能让人满意。在这一研究的基础上，1965年Moskalewski对其进行了改进，采用了剪碎加酶消化的方法进行胰岛的分离，然而该法下胶原酶并不能充分到达整个胰腺，所得胰岛的纯度仍旧较差。两年后Lacy and Kostianovsky进一步改进该法，采用胆总管灌注Hanks的方法充盈胰腺，并将充盈的胰腺剪碎后置于胶原酶中搅动消化。这是首次在胰岛的提取中利用了动物本身的解剖路径来充盈胰腺。随后，在此法的基础上Gotoh等人研究出了胆总管灌注胶原酶、Ficoll密度梯度离心的方法来提取胰岛。该法获得的胰岛产量、功能较以前几种方法有了很大的提高，而且该法耗时少，故而该法一直沿用至今。然而，该法仍有两点值得我们注意。一是胆总管穿刺难度较大，对于手术操作者的要求很高，新手操作十分容易失败。Gotoh等人的方法还有一点值得我们注意的是Ficoll密度梯度离心法，该法需要配制4种不同浓度的Ficoll离心液(25％，23％，20.5％，11％)，Ficoll的配制步骤繁琐复杂，而且Ficoll的价格相对比较高。该法获得的胰岛主要在1.069-1.096这两层密度介质之间。而且Ficoll的渗透压略高于细胞渗透压，对胰岛内的细胞具有一定程度的有害影响。