[发明专利]EGFR基因的多态性检测用探针、扩增用引物及其应用

说明书

本发明提供了能够简便且以优秀的可信度来判别关于EGFR基因中不同多态性的多态性检测用探针、扩增用引物及其用途。选自P5～P7中的至少一种经荧光标记的寡核苷酸作为多态性检测用探针来使用。

本申请是基于申请号为201110348377.2、申请日为2011年10月31日、申请人为爱科来株式会社、发明名称为“EGFR基因的多态性检测用探针、扩增用引物及其应用”的发明提出的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求享有以2010年10月29日提交的日本专利申请号2010-244643为基础的优先权，该申请的全部公开内容通过引用并入本文。

背景技术

本发明涉及EGFR基因的多态性检测用探针、扩增用引物及其应用。

表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor：EGFR)是表皮生长因子(EGF)的酪氨酸激酶受体。已知，EGFR在多种实体癌中高度表达，其过表达与癌症的恶性程度或预后相关联。因此，例如，将吉非替尼等EGFR的酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)作为癌症治疗药物使用。但是，患者中，既有通过吉非替尼肿瘤缩小效果得以提高的情形，也有出现了对吉非替尼的耐药性而无法获得治疗效果的情形。并且，近年，已有研究表明对这类药剂的敏感度与EGFR的突变相关(PLoS Medicine，2005年，Vol.2，No.3，p.225-235和Journalof Clinical Oncology，2005年，Vol.23，No.11，p.2513-2520)。

已知：上述突变例如是EGFR的第790位和第858位上的替换突变，EGFR基因外显子19中的缺失突变(PLoS Medicine，2005年，Vol.2，No.3，p.225-235和Journal of ClinicalOncology，2005年，Vol.23，No.11，p.2513-2520)。上述第790位上的突变是EGFR的第790位氨基酸苏氨酸(T)被替换为甲硫氨酸(M)的突变，序列编号21所示的EGFR基因的部分序列中，第347位碱基胞嘧啶(c)被替换为胸腺嘧啶(t)。上述第858位上的突变是EGFR的第858位氨基酸赖氨酸(L)被替换为精氨酸(R)的突变，序列编号1所示的EGFR基因的部分序列中，第261位碱基胸腺嘧啶(t)被替换为鸟嘌呤(g)。上述EGFR基因外显子19中的缺失突变是上述外显子19中连续几个到十几个碱基缺失的突变，序列编号2所示的EGFR基因的部分序列中，例如，第112-164位碱基中的任何碱基缺失。因此，如果能检测出EGFR基因中有无这样的突变，在治疗前评价对吉非替尼的敏感度，会使更为有效的个体化癌症治疗成为可能。

另一方面，已报道了多种检测基因多态性的方法，例如PCR-RFLP(限制性片段长度多态性，Restriction Fragment Length Polymorphism)法等。

但是，上述PCR-RFLP法操作复杂，并且有扩增产物散布、混入第二次的其他反应的可能。由于存在这样的问题，多态性检测的自动化仍是难题。

由于存在这样的问题，近年来，实施了利用熔解曲线分析(Tm分析)的检测作为基因多态性的检测方法。其是这样的方法：使用与含有检测目标的基因多态性的检测对象序列互补的探针，使检测样品的靶标单链DNA与上述探针形成杂交体(双链DNA)，对该杂交形成体实施加热处理，根据吸光度等信号测定来检测随着温度上升的杂交体解离(熔解)，基于该检测结果确定Tm值，由此判断目标多态性的有无。杂交形成体的同源性越高，Tm值就越高，杂交形成体的同源性越低，Tm值就越低。因此，可以针对含有目标多态性的检测对象序列和与其互补的探针的杂交形成体预先求出Tm值(评价基准值)，然后测定检测样品的靶标单链DNA与上述探针的Tm值(测定值)，如果测定值与评价基准值相同，就能判断靶标DNA中存在目标多态性，如果测定值低于评价基准值，就能判断靶标DNA中不存在目标多态性。