[发明专利]一种吉他霉素工业化生产菌种的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物发酵的菌种制备及培养方法，具体涉及一种吉他霉素工业化生产菌种的制备方法。

背景技术

吉他霉素属大环内酯类抗生素，是一种抗菌药，对革兰氏阳性细菌和阴性细菌、立克次氏体、螺旋体和大型病毒有较强的抑菌作用，并且对部份大环内酯类耐药菌也有效；抗菌谱虽与红霉素相似，但不产生诱导耐药，细菌形成耐药较慢，是一种较好的抗生素替代品种，广泛应用于抗青霉素的葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌感染，同时，在欧美和日本等国吉他霉素也常作为饲料添加剂使用，也是我国农业部《饲料药物添加剂使用规范》I类药物中明确规定可以使用的一种大环内酯类抗生素。目前，吉他霉素种子的制备工艺普遍采用新鲜斜面孢子接种子摇瓶培养再进种子罐培养，由于新鲜斜面孢子在保藏过程中，孢子活力会发生变化，受保藏时间限制，一次不可能制备太多斜面备用，这种工艺制备的种子生长周期不稳定，批次更换频繁，造成了吉他霉素发酵水平的不稳定。

发明内容

本发明的目的是提供一种吉他霉素工业化生产菌种的制备方法。

基于上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种吉他霉素工业化生产菌种的制备方法，包括如下步骤：

a）单菌落制备：将吉他霉素菌种加入0.5-1.0mL无菌生理盐水，震荡均匀，制成菌悬液，接种针蘸取，在分离平板上划线，在26-30℃平板培养6-12天，得到单菌落；

b）斜面孢子制备：取步骤a)制备的单菌落均匀涂布到斜面上，在26-30℃斜面培养6-12天；

c）冻干菌种管制备：在无菌条件下用接种环将斜面孢子刮下，用冷冻真空干燥法制成冻干菌种管，在4℃保藏；

d）牛奶冷冻管制备：将步骤c)制备冻干菌种管开封，加入0.5-1.0mL无菌生理盐水，震荡均匀，制成菌悬液，接种环蘸取均匀涂布到斜面上，在26-30℃斜面培养6-12天，在无菌条件下用接种环将斜面孢子刮下，加入10-25wt%的脱脂牛奶水溶液2mL，分装0.2mL到容量为2.0mL的菌种保藏管中得到孢子牛奶冷冻管，在-20℃~-80℃保藏；

e）进罐种子制备：取步骤d)制备的孢子牛奶冷冻管接入种子摇瓶培养基中，置于26-30℃的

摇床上培养24-48h，料液外观呈棕褐色，镜检菌丝粗壮，染色深，网状，即可进入种子罐培养。

进一步地，步骤a)中平板培养所用培养基的配方为：可溶性淀粉1.0-2.0wt%，酵母浸膏0.1-0.8wt%，硫酸镁0.025-0.075wt%，磷酸二氢钾0.025-0.075wt%，琼脂粉1.5-2.5wt%，余量为水。

步骤b）和步骤d)中斜面培养所用培养基的配方为：可溶性淀粉1.0-2.0wt%，酵母浸膏0.1-0.8wt%，硫酸镁0.025-0.075wt%，磷酸二氢钾0.025-0.075wt%，琼脂粉1.5-2.5wt%，余量为水。

步骤e)所述种子摇瓶培养基的配方为：淀粉1.5-2.5wt%，黄豆饼粉1.0-2.0wt%，氯化钠0.2-1.0wt%，葡萄糖0.5-2.5wt%，蛋白胨0.25-1.0wt%，酵母粉0.1-0.6wt%，硫酸铵0.1-1.0wt%，硫酸镁0.01-0.05wt%，磷酸二氢钾0.01-0.05wt%，余量为水，灭菌前20wt%氢氧化钠溶液调pH至6.8-7.5，120℃灭菌30min，加入占该培养基质量0.2-0.8%的碳酸钙，搅匀、分装，每500mL三角瓶中装50mL培养基。

与现有技术相比，本发明所述方法制备的吉他霉素工业化生产菌种摇瓶种子生长周期在24小时左右，解决了采用传统菌种制备方法制得菌种在种子瓶生长周期时长时短、不固定的问题。因为在生产过程中，各工序基本是按照固定时间进行工作，如果种子生长周期不固定，就会影响发酵罐周期及后面工序的运行，给生产带来不便。如果菌种批次变动太频繁，每批次种子间差异或同一批次前后不均一，会造成生产波动。本发明技术方案首先通过单菌落的挑选过程使种子得到纯化；进一步通过斜面的培养过程，使种子的生长得到同步化；经过制作成牛奶冷冻管保藏，避免新鲜斜面保存时间段，同一批次前后不均一情况发生。

具体实施方式

本发明实施例使用的吉他霉素菌种为吉他链霉菌甘露糖变种，为四川抗菌素研究所提供的吉他霉素生产菌。

实施例1

一种吉他霉素工业化生产菌种的制备方法，包括如下步骤：