[发明专利]一种分离大白菜不同发育阶段小孢子的方法

权利要求书

1.一种分离大白菜不同发育阶段小孢子的方法，其特征在于：制备28%(V/V)~50%(V/V) percoll分离液，将小孢子粗提液置于分离液顶层，150rpm低速离心后，不同发育阶段的小 孢子分布在percoll的不同密度层中。

2.根据权利要求1所述的分离大白菜不同发育阶段小孢子的方法，其特征在于包括以 下具体步骤：

（1）取percoll原液，配成含有13%(m/v)的蔗糖的percoll母液，再按照体积比将 percoll母液与浓度为13%(m/v)的蔗糖溶液配制成28%(V/V)、50%(V/V))percoll分离液；

（2）取步骤（1）750uL的50%(V/V)percoll分离液，置于2ml离心管底部，再小心地添加 28%(V/V)percoll分离液750uL；

（3）将步骤（2）中制备的percoll分离液在4℃条件下静置3h，形成稳定的分离工作液；

（4）将20蕾对应的小孢子粗提液200uL加入步骤（3）的percoll分离工作液顶层，低速离 心40min，离心结束后取出样品管；

分布在50%(V/V)percoll分离液中与28%(V/V)percoll分离液中的小孢子发育时期分 别为单核中期与单核早期；

（5）将步骤（4）所得的小孢子小心抽出，悬浮于13%(m/v)的NLN液体培养基中，在4℃ 迅速离心25min，离心机转数为150rpm，所得沉淀即为纯化后去除percoll的大白菜小孢子， 可作为遗传转化试验受体。