[发明专利]油菜种子发育早期种皮颜色快速鉴定的方法

说明书

技术领域

本发明涉及农业应用生物技术领域，特别是涉及一种油菜种子发育早期种皮颜色快速鉴定的方法。

背景技术

研究表明，在相同遗传背景下，黄色种皮油菜(简称黄籽油菜)与黑色种皮油菜(黑籽油菜)相比具有种皮薄、含油量高、油中色素和杂质少、木质素含量低等优点。目前，黄籽油菜育种是目前油菜育种的热点。油菜种皮颜色要到成熟是才能显现出来，无论是黑籽还是黄籽，种子成熟后胚都是黄色。种子的颜色是由种皮颜色决定的，黑籽油菜的种皮为黑色；黄籽油菜的种皮为透明，黄籽油菜的种子表现出胚的黄色。无论是黄籽还是黑籽在种子发育早期，种皮都是绿色的，育种者在种子发育早期不能对种皮颜色进行选择，需要在种子成熟后才能对种皮颜色性状进行选择，这样存在着费时、费工、费钱等问题。因此，找到一种快速鉴定种子种皮颜色的方法，可以在种子发育早期进行种皮颜色的鉴定方法，对油菜黄籽育种有十分重要的意义。

原花色素是导致拟南芥种子颜色差异的关键物质,油菜与拟南芥同属十字花科，我们推测原花色素可能是油菜种子颜色差异的决定物质。我们在研究油菜黄黑籽形成的生物途径及组成成分时发现，二氢黄酮醇4-还原酶基因（DFR）、花色素合成酶基因(ANS)和花色素还原酶基因(ANR)在油菜黄黑籽种子发育早期表达有差异，DFR等基因在黄籽种皮中不表达，我们推断导致黄黑籽差异可能是DFR等基因所控制合成的物质(黄酮3,4-二醇等类似物，原花色素合成的前体物质)导致的，黄籽种皮中可能没有黄酮3,4-二醇等物质。通过实验研究发现三氟乙酸、铁铵矾等物质在酸性和高温条件下，能与油菜种皮中的原花色素合成的前体物质结合，产生紫红色物质，溶液颜色变为紫红色。

发明内容

本发明的目的在于提供一种直观、经济、简便的油菜种子发育早期快速鉴定种皮色的方法，以便应用于油菜的黄籽育种，并应用于杂交油菜种子纯度的鉴定，对于黄色种皮油菜的杂交种进行纯度的早期鉴定。

本发明采用的技术方案：一种在油菜种子发育早期快速鉴定种皮颜色的方法，其特征是把授粉8天后的种皮放入透明容器中，加入溶液A在常温下浸泡15-20分钟，然后加入染色试剂B,煮沸15-30分钟后，在冰上冷却20-25分钟，根据反应后液体颜色的变化来鉴定油菜种子的颜色，放入黑籽油菜种皮的容器中液体颜色变为紫红色，而放入黄籽油菜种皮的容器中液体颜色没有紫红色产生。

所述的溶液A与染色试剂B的体积比为1：5-7。

所述的溶液A由甲醇、丙酮、水、三氟乙酸组成，其体积比为38-42：30-34：26-30：1。

所述的染色试剂B由正丁醇、6mol/L的盐酸和3%铁铵矾溶液组成，它们的体积比为89:10:1。

本发明提出的在油菜种子发育早期快速鉴定种皮颜色的方法，其步骤如下:

（1）配置溶液A：由甲醇、丙酮、水、三氟乙酸组成，其体积比依次为38-42：30-34：26-30：1，混匀。

（2）配置染色试剂B：由正丁醇、6mol/L的盐酸和3%铁铵矾溶液组成，它们的体积比依次为89:10:1，混匀。

（3）取10-20粒授粉8天后的种皮，放入透明的容器中。

（4）加入1毫升溶液A，使种皮完全浸泡在液体中，常温下放置15-20分钟。

（5）加入5-7毫升染色试剂B,煮沸15-30分钟。

（6）在冰上冷却20-25分钟，观察液体颜色的变化。放有黑籽油菜种皮的容器中液体变为紫红色；而放有黄籽油菜种皮的容器中的液体没有紫红色产生。

本发明人从油菜种皮颜色形成的生物学等途径入手，深入研究了种皮颜色形成途径中的关键酶的作用机理、酶作用的产物及其相互关系，发现在油菜黄黑籽种皮发育过程中差异的物质是黄酮3，4-二醇及类似物等(这些物质是无色的)。本发明用化学染色法，加入试剂与种子中黄酮3,4-二醇等物质反应产生红色物质，从而能简便、直观在种子发育早期区分黄黑籽。该方法操作简单，分析速度快，使用试剂价格低廉。

具体实施方式

实施例1:

（1）配置溶液A：由甲醇、丙酮、水、三氟乙酸组成，其体积比依次为38：30：26：1，混匀备用。

（2）配置染色试剂B：由正丁醇、6mol/L的盐酸和3%铁铵矾溶液组成，它们的体积比依次为89:10:1，混匀备用。

（3）分别取10粒授粉8天后的黑籽芥菜型油菜紫叶芥、平陆芥菜、棱角6号和黄籽芥菜型油菜四川黄籽、内蒙大黄的种皮放入透明的容器中。