[发明专利]表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的重组质粒及其表达方法

说明书

本发明公开了一种表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的重组质粒及其表达方法，该重组质粒通过将人乳头瘤病毒16亚型L1基因和SUMO标签基因插入表达质粒中构建而成。本发明对HPV16 L1基因进行优化，使其更适合在大肠杆菌宿主中高效率表达目标蛋白，同时，本发明首次应用Sumo标签表达系统在大肠杆菌中融合表达，更进一步增加了目的蛋白的可溶性，使表达的目的蛋白具有更高活性。本发明的方法显著提高了目的蛋白可溶性表达的效率，且产品性质均一、稳定，发酵破菌液上清中的目的蛋白表达量可达到70μg/ml，这一数值明显高于本发明目的蛋白在其他原核表达系统中的产量，从而满足工业化生产的要求。

技术领域

本发明涉及一种表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的重组质粒、构建方法、重组工程菌及其表达方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)是一类双链小分子DNA病毒，具有严格的种属特异性，主要感染人的皮肤和粘膜组织，引起相应部位上皮组织的增生性病变。1977年Laverty(Laverty,C.R.,Russell,P.et al.1977)在电镜中观察到宫颈癌组织中存在HPV颗粒，1981年，Zur Hausen(H zur Hausen.et al.1981)提出HPV可能与宫颈癌发病有关的假设。此后，这一观点被越来越多的实验所证实。宫颈癌发病与人乳头瘤病毒(humanpapilloma virus，HPV)感染有直接关系，采用灵敏的检测方法，可以从几乎100％的宫颈癌患者病变组织中检测到高危HPV-DNA。

根据核酸序列同源性，目前发现的HPV约有200多种基因型，其中与人类生殖道感染有关的有40多种，依致病性不同，可分为高危型和低危型两类，HPV感染者发展为子宫颈癌的几率约0.2％。其中宫颈癌患者中，约50～60％是由HPV-16感染引起(WalboomersJ.M.et al.,1999)，在世界范围内，HPV-16是与宫颈癌联系最紧密的基因型，并随地域变化很小(Doorbar,J.,2005)。另外HPV18、33、45、52和58与宫颈癌的发生高度相关。全球每年有约50万妇女患宫颈癌(Koutsky L.A.et al.,1988)，其中约27万因宫颈癌死亡(80％以上在发展中国家)，宫颈癌发病率仅次于乳腺癌。

因此，开发一种价格适宜、保护性良好的宫颈癌疫苗，特别是针对HPV-16的疫苗，对于降低妇女宫颈癌发病和死亡率意义重大。

HPV基因组长约8kb，分子量约为5×10⁶道尔顿，直径为50～60nm，正二十面体结构。核心为单拷贝的基因组DNA，病毒衣壳由主要衣壳蛋白(L1)和次要衣壳蛋白(L2)组成。其中，L1蛋白是较大的衣壳蛋白，分子量为55-60kDa，为主要衣壳蛋白，是高度保守的糖蛋白，具有高度的免疫原性，也是HPV分型的依据，同时体外表达的HPV L1蛋白可自组装成病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)(Kirnbauer,R.et al.,1992)。L2蛋白为次要衣壳蛋白是高度可变核蛋白，反映HPV抗原的多态性(Wang,J.W.,Roden,R.B.,2013)。而且在病毒壳粒中大多数L2蛋白在L1蛋白内部，因此，在开发宫颈癌疫苗时，针对衣壳蛋白L1开发具有更好的针对性。

根据现有研究结果，L1基因是一个好的免疫预防靶。在细菌中表达的L1蛋白或使用疫苗载体的L1蛋白用于免疫，可保护动物不受病毒感染。在酵母细胞及杆状病毒表达系统中表达HPV L1基因组装成病毒样颗粒(VLP)，该病毒样颗粒已经用于诱导与保护免受病毒侵袭有关的高效价病毒中和抗体应答。再者，VLP在形态学上与HPV毒粒完全相同，但不含有潜在的病毒致癌基因，因此能诱导抗体应答而无感染或致癌危险性，在一定程度上，能够替代天然病毒，经免疫后可诱导产生型别特异性中和抗体，有效保护机体免受同型病毒的感染或再感染，因此VLP是HPV疫苗试验中最好的免疫原候选者之一。