[发明专利]高通量多位点人类短片段串联重复序列检测试剂盒及其制备和应用

说明书

本发明涉及法医学、刑侦及物证鉴定等领域，具体涉及一种人类短片段串联重复序列检测试剂盒及其制备和应用，该检测试剂盒，包含由不同样本标签标记的人类短片段串联重复序列特异性的多重PCR引物池、免DNA提取PCR扩增酶、PCR反应缓冲液以及任选的对照DNA、DNA纯化磁珠，该试剂盒具有高分辨度、高准确性和高通量的特点。

技术领域

本发明涉及法医学、刑侦及物证鉴定等领域，具体涉及一种人类短片段串联重复序列检测试剂盒及其制备和应用，所述试剂盒具有高分辨度、高准确性和高通量的特点。

背景技术

在法医、刑侦及物证鉴定等工作中如何追踪、认定嫌疑人；在犯罪、灾害等事件中如何判定相关人员或遇难者；在亲属认定中如何确定亲缘关系等等是人类文明史中早就出现并不断探索的目标。当100多年前遗传学由于孟德尔(G.J.Mendel)的奠基性工作而成为一门学科以后，随着遗传学的每一个进展都使上述的工作有了更坚实的科学基础。

1985年英国遗传学家杰弗瑞斯(A.Jeffreys)首次提出所谓“DNA指纹”，指出在人类基因组中的某些区域具有重复序列，而且这类重复序列有个体差异(多态性)并能够遗传。使用DNA来行使个体鉴定有许多优点：(1)DNA作为遗传信号的载体存在个体差异，表现为形状上的差异；(2)DNA作为遗传的载体又是稳定的、与亲缘关系的基础；(3)人体上任何有核的细胞都可以作为DNA分析的对象；(4)DNA样品的稳定性较好。

最早用于检测遗传多态性的方法是使用限制性内切酶对人类基因组中可变数目串联重复(VNTR)做限制性片段长度多态性分析(RFLP)，但是这个方法的缺点在于需要较为完整(分解的程度较低)并较为大量的样品，这对法医现场来说有时无法实现，同时，该方法的分辨度也较低。随着技术的发展，DNA聚合酶链式反应(PCR)的出现使对样品量的需求大大降低，将分析目标集中到VNTR中的短片段串联重复(STR)序列，又使得较短的核酸片段也能够用于分析，加上多重PCR技术的应用，迅速使STR基因座的分型检测在法医和刑侦中迅速推广，并使收集相关人群STR分析结果的数据库日益扩大。

上述基因组中同一位点上的多态性表现为在这一位点上有两个或多个不同的核酸一级结构(核苷酸的种类或重复序列的个数等)，被称为等位基因，分析等位基因的结构被称为基因分型。等位基因越多基因型就会越多，如等位基因的数目为n，就意味着有n种纯合子和n(n-1)/2种杂合子。例如在某一位点上有10个等位基因，就应该存在10种纯合子和45种杂合子，即在这一位点上存在55种等位基因。在个体鉴定中需要同时检测多个位点(基因座)上的多态性，如果它们都是不连锁的，其基因座的频率可以相乘，如果提高基因座的数目就有可能大大提高个体鉴定的可信度。

上世纪90年代以来对STR通用的检测方法是以多重PCR检测约20个基因座的基因型，在检测中使用以荧光标记的引物并设计好扩增子的长度，使所产生的不同长短的具有荧光标记的针对每个基因座的扩增子在毛细管电泳中分离，并与标准物进行比对，从而实现对每个基因座中的等位基因进行分型。但是，这种方法也存在着由于技术上的限制而带来的缺陷，主要有：(1)由于荧光标记物的相互干扰和毛细管长度及成像技术等方面的限制，被分析基因座的数目已难以进一步大幅提升；(2)由于分析的对象是各个片段的长度大小，无法进一步检测到组成片段的核酸一级结构的微小差异，因此限制了检测的分辨度；(3)出峰宽度受电泳条件影响，导致碱基个数相差1-2bp时难易分辨；(4)Stutter峰(片段分析中时而出现于主峰前的小峰)的干扰，尤其是存在混合样品时。

高通量测序法可以弥补以上缺陷，(1)检测位点数几乎不受平台限制；(2)核心重复数一致的情况下，测定出的序列微变异可以进一步区分不同个体，提高检测的分辨度；(3)序列信息直接反映核心重复数，更加准确。但同时高通量测序具有成本高，操作复杂的缺陷，只有提高样本检测通量至几百人份，并简化操作流程至1个工作日内，才有可能使该技术真正应用于STR的实际检测。