[发明专利]基于8-17DNAzyme原理的铅离子荧光检测方法及其应用

说明书

本发明公开了基于8‑17 DNAzyme原理的铅离子荧光检测方法及其应用。在Pb²⁺作用下，8‑17 DNAzyme可以催化断裂其互补底物链，利用固定在芯片表面的探针捕获断裂后释放到溶液中的带荧光标记的部分底物链，借助于倏逝波激发捕获的底物链，建立荧光信号与Pb²⁺浓度的关系。本发明的检测方法可在室温(20‑30℃)20分钟完成Pb²⁺的检测，对Pb²⁺的最低检测限为20nM。本发明的检测方法可在室温能够快速、准确地进行饮用水中铅离子(Pb²⁺)的检测，而且特异性强，不受其它金属离子的干扰，重复性好。本发明的检测方法具有特异性强、性能稳定、易于再生、检测成本低、并能与仪器结合的优势。

技术领域

本发明涉及生物传感器检测重金属离子领域中基于8-17DNAzyme原理的铅离子荧光检测方法及其应用。

背景技术

铅污染具有毒性大、致毒剂量低、易累积、难降解、难治理等特点，因而是目前环境监测和治理的重点。《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)严格限定饮用水中铅(Pb²⁺)离子浓度不能高于0.01mg/L等。同时GB/T 4470-1998、GB/T 20380.1-2006、GB/T 23362.4-2009等标准就分别规定了使用原子荧光光谱分析法(AFS)、原子吸收分光光度计法(AAS)和电感耦合等离子体质谱分析法(ICP-MS)作为痕量铅离子检测的标准方法。但是上述方法样品前处理方法复杂，仪器设备昂贵，检测费力、费时、成本高，此外样品必须经专业人员进行操作，难以实现快速的现场检测或对突发水污染事件做出快速响应。

现代分子生物学研究发现，在分子水平上某些重金属离子可与特异的基因序列发生作用，造成其空间结构发生改变，而这种结构和性能的关系为重金属离子的快速、特异识别提供了一条便捷的途径。脱氧核酶(DNAzyme)由一个碱基环和两条单链侧臂构成，是具有催化功能的单链DNA片段，它是利用体外分子进化技术(SELEX)合成的，具有很高的催化活性和结构识别能力，能将与其互补的DNA链或RNA链连接或切断。

2000年，美国伊利诺伊大学香槟分校的Lu教授等人筛选出对铅离子具有高亲和、特异结合的8-17DNAzyme，并设计出一种“turn on”模式的检测策略(即铅离子浓度与荧光强度成正比)快速检测水体中铅离子的浓度。具体方法为在8-17DNAzyme互补底物链(17DS)3’末端标记上了一个荧光基团，而在8-17DNAzyme的5’末端标记一个淬灭基团，当8-17DNAzyme与17DS杂交后，由于荧光基团与淬灭基团相邻，根据荧光共振能量转移(FRET)效应，将不产生荧光；而在铅离子存在下，水溶液中的8-17DNAzyme可对17DS链上的识别位点(一个RNA腺嘌呤)进行攻击，导致17DS断裂，从而使淬灭基团与荧光基团分离，产生荧光，并且荧光的强度与铅离子的浓度成正比。在该体系下Pb²⁺的线性检测范围为10nM到4mM，检出限远低于EPA(美国环境保护署)饮用水中铅离子含量标准，此外该体系中Pb²⁺表现出明显的特异性，较其它二价离子灵敏度高出至少80倍，但该体系需要在4℃下反应，严重限制了其应用。

中国发明专利申请CN 102031284 A(发明人是赵建龙等)利用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳化二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)方法，将3’端修饰-NH₂的8-17DNAzyme链固定在芯片表面，并设计开发了“turn off”模式(即铅离子浓度与荧光强度成反比)的光学检测Pb²⁺的方法。他们首先使8-17DNAzyme链与标记有荧光基团的底物链杂化，接着引入Pb²⁺，在8-17DNAzyme作用下底物链断裂，荧光强度逐渐减弱。该方法耗时1小时，检出限可达1nM，线性范围为1nM-10μM，多次重复再生检测对于灵敏度基本无影响。