[发明专利]一种副猪嗜血杆菌的培养方法及其灭活方法

说明书

技术领域

本发明涉及菌种发酵培养和灭活领域，更具体地说涉及一种副猪嗜血杆菌的培养方法及其灭活方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌是巴氏杆菌科的一种短小革兰阴性杆菌，主要引起的猪多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎的传染病，主要感染断奶前后仔猪。近年来，由该菌直接感染或混合感染给养猪业带来一定的经济损失已成为猪的主要病原之一。

副猪嗜血杆菌在培养基上生长缓慢，对营养条件要求高，在进行副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的制备时，副猪嗜血杆菌培养的活菌浓度直接影响疫苗的质量，同时良好的灭活条件对疫苗的产业化也有一定的影响。

发明内容

本发明提供了一种副猪嗜血杆菌的培养方法及其灭活方法，使其副猪嗜血杆菌各菌株获得最适宜培养和灭活条件，以便制定疫苗的产业化生产工艺。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种副猪嗜血杆菌的培养方法，包括以下步骤：(1)一级种子液的制备；(2)二级种子液的制备；(3)微生物发酵罐扩大培养；其特征在于，所述的扩大培养中副猪嗜血杆菌二级种子液接入量为2％(V/V)。

进一步地，所述的副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌SD02株、HN02株、GZ01株和JX03株。

进一步地，所述的扩大培养所用培养基为含5％新生牛血清和12μg/mL的NAD的TSB培养基。

进一步地，所述的扩大培养条件为搅拌速度为100～150转/分，培养温度37℃，培养时间8～10小时。

进一步地，所述的副猪嗜血杆菌各菌株活菌数均≥7.0×10⁹CFU/mL。

进一步地，所述的灭活方法为加入菌液总量0.4％的甲醛，37℃灭活24小时。

有益效果：本发明的培养方法获得各菌株活菌数高且稳定，同时培养成本低，灭活时间为24h，大大的缩减了生产周期，对疫苗的产业化生产工艺有很大的提高和改善。

具体实施方式

下面详细说明本发明的具体实施，有必要在此指出的是，以下实施只是用于本发明的进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域技术熟练人员根据上述本发明内容对本发明做出的一些非本质的改进和调整，仍然属于本发明的保护范围。

菌种：副猪嗜血杆菌血清4型SD02株、5型HN02株、12型GZ01株、13型JX03株，由山东华宏生物工程有限公司提供。

培养基和试剂：含10％血清的TSA培养基和TSB培养基、甲醛溶液，由山东华宏生物工程有限公司研发部实验室配制。

发酵罐：由山东华宏生物工程有限公司提供。

试验动物：3～5周龄健康易感猪，由山东华宏生物工程有限公司试验定点猪场提供；经间接血凝试验，其副猪嗜血杆菌间接血凝抗体效价≤1:4。

实施例1副猪嗜血杆菌生产用种子制备

取副猪嗜血杆菌SD02株、HN02株、GZ01株和JX03株冻干菌种分别用含NAD和新生牛血清的TSB培养基溶解后，划线接种于含NAD和新生牛血清的TSA平皿上，置37℃培养24小时，挑选5个典型菌落，接种含NAD和新生牛血清的TSA固体培养基，37℃培养24小时，作为一级种子。用TSB培养基洗下固体培养基上的一级种子菌落，接种于含5％新生牛血清和12μg/mLNAD的TSB培养基，置37℃振荡培养8～10小时，取样经纯检合格后作为二级种子。

实施例2二级种子接种量的确定试验

种子接种量是指接入的种子体积和培养基体积的比例。

制苗用培养基为含5％的新生牛血清和12μg/mLNAD的TSB培养基。

以1％、2％、4％和5％(V/V)的比例分别接种SD02株、HN02株、GZ01株、JX03株的二级种子，37℃培养，静止培养2小时后，设定搅拌速度为100转/分，培养12小时，每隔2小时取样，进行活菌计数，测定不同接种量不同培养时间菌液中的活菌数，确定二级种子的最佳接种剂量。

将副猪嗜血杆菌各菌株二级种子以不同接种量接入发酵罐中培养不同时间后分别取样进行活菌计数，计数结果见表1～表4。

表1副猪嗜血杆菌SD02株不同接种量、不同培养时间的活菌计数结果

表2副猪嗜血杆菌HN02株不同接种量、不同培养时间的活菌计数结果

表3副猪嗜血杆菌GZ01株不同接种量、不同培养时间的活菌计数结果

表4副猪嗜血杆菌JX03株不同接种量、不同培养时间的活菌计数结果