[发明专利]一种非对称转座子及其应用

说明书

本发明提供了一种非对称转座子及其应用。所述的非对称转座子的应用方法包括：将目的基因克隆至转座子目标质粒；将纯化的转座子、含有目的基因的质粒与转座酶在缓冲液中混合进行转座子反应；将转座反应产物转化进大肠杆菌感受态细胞，对读码框内的转座子插入进行筛选；收集获得菌落，提取质粒DNA，此为转座子随机插入文库；以转座子随机插入文库DNA为模板，进行PCR扩增，将纯化的PCR产物依次进行Bsg I酶切和平末端处理，然后进行连接反应，得到缺失突变文库。本发明可实现1至5个氨基酸缺失。

技术领域

本发明涉及一种非对称转座子及其对蛋白质基因进行随机位点的多密码子缺失突变的应用。

背景技术

现有的Mu转座子(Mu transposon)体外突变技术^[1]包括可实现三联核苷酸缺失的MuDel转座子突变^[2]、可实现三联核苷酸替换的MuDel转座子突变^[3]、可实现单一密码子替换的转座子突变^[4]、可实现多个密码子替换的转座子突变^[5]以及通过组合Mu转座子突变和多步酶切实现的多核苷酸替换技术^[6]。本发明是Mu转座子(Mu transposon)体外突变技术的一个分支技术，可实现对目的蛋白的编码基因进行随机位点的多个密码子缺失突变。

参考文献：

1.Haapa，S.，Taira，S.，Heikkinen，E.，Savilahti，H.，1999.An efficient andaccurate integration of mini-Mu transposons in vitro：a general methodologyfor functional genetic analysis and molecular biology applications.NucleicAcids Res.27，2777-2784.

2.Jones，D.D.，2005.Triplet nucleotide removal at random positions in atarget gene：the tolerance of TEM-1beta-lactamase to an amino aciddeletion.Nucleic Acids Res.33，e80.

3.Baldwin，A.J.，Busse，K.，Simm，A.M.，Jones，D.D.，2008.Expanded moleculardiversity generation during directed evolution by trinucleotide exchange(TriNEx).Nucleic Acids Res.36，e77.

4.Daggett，K.A.，Layer，M.，Cropp，T.A.，2009.A general method for scanningunnatural amino acid mutagenesis.ACS Chem.Biol.4，109-113.

5.Liu，J.，Cropp，T.A.，2012.A method for multi-codon scanningmutagenesis of proteins based on asymmetric transposons.ProteinEng.Des.Sel.25，67-72.

6.Kim，Y.C.，Morrison，S.L.，2009.N-terminal domain-deleted mutransposase exhibits increased transposition activity with low target sitepreference in modified buffers.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.17，30-40.

发明内容