[发明专利]同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合和通用型半套式RT-PCR方法有效
| 申请号： | 201510901924.3 | 申请日： | 2015-12-09 |
| 公开（公告）号： | CN105400782B | 公开（公告）日： | 2018-09-07 |
| 发明（设计）人： | 刘新生;方玉珍;王永录;张永光;潘丽;吕建亮;周鹏;张中旺;邵军军;赵付荣;陈豪泰;丁耀忠;孙跃峰;常慧芸;张杰 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院兰州兽医研究所 |
| 主分类号： | C12N15/11 | 分类号： | C12N15/11;C12Q1/686 |
| 代理公司： | 北京中恒高博知识产权代理有限公司 11249 | 代理人： | 张秋云 |
| 地址： | 730000 甘肃*** | 国省代码： | 甘肃;62 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 同时 鉴定 种猪 流行性 腹泻 病毒 引物 组合 通用型 半套式 rt pcr 方法 | ||
1.同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合，其特征在于，所述引物组合由4个特异性引物组成，分别为：
上游引物F1：5’-ATGGTACGTTGCTAGTGCGTA-3’；
上游引物F2：5’-TGGTGAAATCCAGAGTGTCAAT-3’；
上游引物F3：5’-CCAGCTTATATGCAGGATGGAA-3’；
下游引物UR：5’-TACCATGCACCAAAGTGGAATCAT-3’；
所述三种猪流行性腹泻病毒毒株的GenBank序列号分别为：KM392229、KM392224和KM392232。
2.同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒的通用型半套式RT-PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取样品总RNA；
2）反转录得到样本cDNA；
3）利用权利要求1所述的引物F1和UR进行第一轮PCR扩增，区分出S197aa缺失株，即GenBank序列号为KM392229的猪流行性腹泻病毒毒株；
4）分别利用权利要求1所述的引物F2和UR、引物F3和UR进行第二轮PCR扩增，区分出原始毒力株和变异株，即区分出GenBank序列号为KM392224和KM392232的猪流行性腹泻病毒毒株。
3.根据权利要求2所述的同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒的通用型半套式RT-PCR方法，其特征在于，所述步骤3）中，PCR反应体系为25μl，内含PCR缓冲液5μl、MgCl2 2.5μl、dNTP 1μl、权利要求1所述的上游引物F1和下游引物UR各1μl、Taq DNA聚合酶0.5μl、无菌水11μl和cDNA模板3μl；PCR反应条件为95℃预变性2分钟，然后95℃ 35秒、60℃35秒、72℃ 30秒，共30个循环，最后72℃延伸1分钟。
4.根据权利要求2所述的同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒的通用型半套式RT-PCR方法，其特征在于，所述步骤4）中，PCR反应体系为25μl，内含PCR缓冲液5μl、MgCl2 2.5μl、dNTP 1μl、权利要求1所述的上游引物F2和下游引物UR、上游引物F3和下游引物UR各1μl、Taq DNA聚合酶0.5μl、无菌水11μl和cDNA模板3μl；PCR反应条件为95℃预变性2分钟，然后95℃20秒、55℃ 20秒、72℃ 15秒，共25个循环，最后72℃延伸1分钟。
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