[发明专利]血清样本中葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物的分析方法

说明书

本发明公开了一种血清样本中葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物的分析方法，采用甲醇提取，待样品冻干后进行两步衍生用于气相色谱‑三重四级杆质谱联用仪分析。采用多反应监测模式进行检测，对于低含量的代谢物，优化得到丰度最佳的离子对作为定量离子对，提高灵敏度；而对于高含量的代谢物，优化后选取丰度低的离子对作为定量离子对，以拓宽其线性范围，以实现高、低丰度代谢物的同时分析。本发明的分析方法具有前处理简单、重复性好、灵敏度高、线性范围宽等优点。

技术领域

本发明涉及分析化学领域和生物化学领域，是一种基于气相色谱-三重四级杆质谱联用多反应监测模式进行血清样本中葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物分析的方法。

背景技术

葡萄糖是糖在血液中的运输形式，在机体糖代谢中占据主要地位，是维持生命活动的重要物质。葡萄糖通过糖酵解转变为丙酮酸并产生能量，丙酮酸在有氧条件下经过三羧酸循环和氧化磷酸化彻底氧化形成CO₂和H₂O，产生大量自由能；而在无氧条件下则转化为乳酸。葡萄糖经糖酵解到彻底氧化不仅为机体提供大量自由能，而且为一些物质合成提供前体物质，其代谢异常与癌症、心血管疾病、代谢综合征、糖尿病等多种疾病密切相关。因此建立简单、稳健、高灵敏的葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物的分析方法将为与其代谢相关的生理和病理研究提供帮助。

葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物在血中浓度差异非常大，根据HMDB数据库(http://www.hmdb.ca/)中给出的浓度含量范围，相关代谢物的浓度最大相差4个数量级，对其分析造成了很大困难。近年来出现多种技术用于葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物的分析。Luo等报道了基于液质联用的靶向分析方法，但存在灵敏度及覆盖度等问题；Ye等报道了基于气质联用的拟靶向方法，存在覆盖度的问题。在定量分析方面，通常对葡萄糖和三羧酸循环中间产物进行分别分析。葡萄糖的测定主要有酶法、电化学法、光化学法等；三羧酸循环中间产物的定量分析多用气质联用的方法，如Calderón-Santiago等采用氯仿甲醇水双相提取，选择离子扫描模式检测，但存在提取复杂、溶剂毒性大等问题。气相色谱-三重四级杆质谱联用技术，作为靶向分析强有力的工具，通过气相色谱分离结合两级质谱的选择离子扫描，最大限度地排除基质干扰，具有灵敏度高、线性范围宽等优点；且尚未见基于气相色谱-三重四级杆质谱联用多反应监测模式分析葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物的相关报道。

发明内容

本发明针对现有方法的不足，建立了气相色谱-三重四级杆质谱联用多反应监测模式进行葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物的分析方法,可一次进样分析得到血清中葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物的含量，用于相关疾病代谢的研究，为了解机体的生理过程及疾病的发生发展机制等提供依据。该方法具有前处理简单、灵敏度高、重复性好、线性范围宽等优点。

本发明采用的技术路线如下：

(1)将-80℃保存的血清样本解冻，涡旋10s，准确移取50μL，加入含内标的甲醇溶液200μL，涡旋1min。甲醇溶液中内标浓度分别为：乳酸-3,3,3-d₃(100μg/mL)，琥珀酸-2,2,3,3-d₄(0.2μg/mL)，富马酸-2,3-d₂(0.1μg/mL)，柠檬酸-2,2,4,4-d₄(5μg/mL)，葡萄糖-¹³C₆,1,2,3,4,5,6,6-d₇(150μg/mL)。4℃下14000rpm离心15min，取200μL上清溶液冷冻干燥。

(2)于冻干血清样本中加入50μL甲氧胺溶液(20mg.ml，吡啶)，涡旋30s，超声1min，37℃水浴中反应1.5h；待反应结束，加入40μLN-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，涡旋10s，37℃水浴中反应1h；反应完成后，4℃下14000rpm离心10min，取上清溶液用于分析。

(3)气相色谱-三重四级杆质谱联用仪器用于样本分析。