[发明专利]一种硫巯化多肽的富集方法

权利要求书

1.一种硫巯化多肽的富集方法，其特征在于：

步骤1）以多氨基树枝状聚合物为载体，通过共价修饰碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯，反应产物置于超滤膜上，离心，除去未反应完的碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯，再用磷酸缓冲盐清洗，制备成选择性与含巯基多肽反应的水溶性高分子化合物，其中在步骤1）体系中，碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯加入摩尔量为多氨基树枝状聚合物的1-100倍；

步骤2）通过将制备得到的水溶性高分子化合物与蛋白质酶解产物充分混合，室温避光反应后置于超滤膜上，离心，选择性将含巯基多肽截留在膜上；

步骤3）在膜上加入二硫键还原剂，选择性将硫巯化多肽从高分子化合物上释放，通过离心，获得硫巯化多肽。

2.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：

步骤1）所述选择性与含巯基多肽反应的水溶性高分子化合物的制备步骤为将多氨基树枝状聚合物、甲醇、磷酸缓冲盐、以及碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯充分混合后，避光振荡反应0.5-24小时；离心转速为5000 rpm至20000 rpm，离心时间为0.5小时以上；

在步骤1）体系中，甲醇加入量为步骤1）体系总体积的50%-80%，磷酸缓冲盐浓度为0.01-0.5M, pH为7-9；步骤1）中所述多氨基树枝状聚合物的分子量范围为30000 Da-100000 Da。

3.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：步骤2）中水溶性高分子化合物与蛋白质酶解产物充分混合后，室温避光振荡反应0.5-24小时，形成水溶性高分子-巯基多肽复合物，将复合物置于超滤膜上；进行离心，离心转速为5000 rpm至20000 rpm，离心时间0.5小时以上，再用磷酸缓冲盐清洗。

4.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：步骤2）中所述超滤膜的截留分子量为3000 Da至10000Da；步骤2）中蛋白质酶解产物加入量为水溶性高分子化合物质量的0.1-1倍。

5.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：步骤3）中所述二硫键还原剂为0.5-1M的巯基乙醇、二硫苏糖醇、磷酸三氯乙酯中的一种；

其中二硫键还原剂加入摩尔量为蛋白质酶解产物摩尔量的0.5%-2%。

6.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：步骤3）中所述二硫键还原剂选择性将硫巯化多肽从高分子化合物上释放，25℃-90℃下，反应0.5-3小时，断裂硫巯化多肽上的二硫键，进而释放出多肽。

7.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：所述方法应用于蛋白质酶解产物样品中硫巯化多肽的规模化富集，所述蛋白质为细胞、组织、体液提取物中的一种或二种以上。

8.按照权利要求1或2所述的富集方法，其特征在于：多氨基树枝状聚合物为以1,4-丁二胺为核心的氨基乙醇树枝状聚合物中的一种或二种以上。