[发明专利]一种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法

说明书

本发明公开了一种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法，该方法包括以下步骤：将iPS细胞消化后吹吸分散成单个细胞悬液，分种在培养孔中，每孔加入ROCK抑制剂；分种后的第一天，吸弃上清液，加入神经诱导完全培养基，培养直至获得P1代的神经干细胞；将P1代的神经干细胞接种到神经元诱导培养基中培养，培养基中要添加雷帕霉素以促进自噬的发生；2天后，将培养基更换为添加低浓度的雷帕霉素以促进自噬的神经元细胞分化培养基，培养至12‑15天可诱导分化为神经元细胞。本发明方法可加快神经元的诱导分化形成，并且改善了脊髓小脑共济失调三型iPS的神经元生长状态。

技术领域

本发明涉及一种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法，该方法通过增强自噬提高诱导分化效率。

背景技术

神经元是一种不可再生的细胞，因此在人类一些损伤神经元的疾病中，会产生一些不可逆的后果。随着人类寿命的延长，阿尔茨海默病、脑血管意外等神经元受累的疾病增加，而人的诱导多能干细胞可诱导分化为有功能的神经元，该技术为治疗这一类疾病提供了可能性。但是从诱导多能干细胞或者胚胎干细胞诱导分化为神经元需要繁杂的过程，如涉及悬浮培养或者外源细胞共培养的方法。这些方法均有操作繁琐及耗时长等缺点。而Drury-Stewart等使用一些小分子，很好地解决了悬浮及外源细胞共培养等问题。Life公司也有相关的试剂盒产品解决了这一问题。但是从诱导多能干细胞或者胚胎干细胞诱导为神经元需要数周，耗时长的问题仍未得到很好的解决。因此亟需一种简便快捷的方法进行神经分化。

自噬(autophagy)是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。

脊髓小脑性共济失调(Spinocerebellar Ataxia，SCA)是一组遗传异质性很大的神经系统变性疾病。ATXN3基因编码ATAXIN-3蛋白，该基因CAG拷贝数动态突变时，其编码的蛋白羧基端多聚谷氨酰胺(polyglutamine,PolyQ)链异常扩展以及蛋白质的异常聚集，引起细胞功能障碍，从而引起神经毒性而致病。除了传统的泛素蛋白酶降解系统，自噬是真核细胞中一种高度保守的、通过溶酶体机制途径发挥作用的降解通路，与神经退行性疾病等疾病密切相关。研究表明诱导自噬能够降解聚集突变的ATAXIN-3蛋白，从而防止SCA3/MJD以及其他神经退行性疾病的发生。SCA3诱导多能干细胞是很好的研究SCA3发病的工具。但是自噬在SCA3诱导多能干细胞诱导分化为神经元中起到的作用尚需明确。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法，包括以下步骤：

(1)融合度70-80％的人诱导多能干细胞(iPS细胞)，加入预热的细胞消化液后37℃孵育5分钟，接着用移液管吹吸若干次，使细胞分散成单个细胞悬液，然后将细胞分种在培养孔中；每孔加入ROCK抑制剂后放入37℃、5％CO₂的培养箱中培养；

(2)分种后的第一天，吸弃培养孔的上清液以除去未贴壁的细胞，加入预热的神经诱导完全培养基，置于培养箱中继续培养；此后隔天换液，分种后第七天可获得P0代的神经干细胞(NSCs)，继续培养3-4天获得P1代的神经干细胞；